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第三章 组织化学的基本技术 ? 组织化学发展到今天，它的技术多而复杂，但基本技术是容易掌握的。从样品的取材、固定剂的选择、切片的制备、孵育反应、各种溶液的配制以及光镜组织化学技术和电镜组织化学技术等，每项技术都有明确的要求和规范的操作程序。进行没项工作，应事先做好准备，按技术程序进行，可做一定的预备实验，效果稳定后，再开始实验研究，这样才能达到预期的科研效果。 ?一、???? 样品的取材 样品制备的第一步就是取材，取材的好坏关系到实验的结果。所以必须做好准备工作。如取材的器材；动物标本准备，一般轻微麻醉，迅速取材为好。现将取材的原则和具体要求分述如下： ⑴??刀剪锐利、洁净。 ⑵ 快速、准确、尽量保持生活状态，力争1 分钟之内放入固定液，最迟不能超过3分 钟。要清楚取材的部位和内部，对病理 组织还应做到以下几点： ①???材部位必须是主要病变区。 ② 必须取病灶与正常组织的交界区 ③ 必要时取远离病灶的正常组织做对照。 ⑶ 一刀切取，切取应在蜡版或滤纸上进行， 避免拉锯、牵拉或挤压等动作。 ⑷ 低温操作，防止自溶现象，通常以0℃-4℃ 的低温条件下操作为佳。 ⑸ 定位准确，取材时必须注意样品的定向和 定位，即头、尾、左、右以及上、下方向。 切好的样品贴放在滤纸片上，标记好定向标 志，防入预冷固定液内，或冰冻切片或短时 间冷冻保存。 ⑹ 样品大小适当，光镜样品一般在1.0cm以内， 免疫组织化学样品大约在 : 2cm×1.5cm×0.3cm[厚度控制在0.3cm]。 电镜样品规格要求切成0.5-1.0cm3小块。 二、 固定 ?1．固定的目的要求 固定是将组织尽可能保持原有生活状态以 适用于某些研究程序的一种方法。固定有 如下几方面的目的。 ⑴ 不仅保持组织生前的形态结构，还要保持 结构的化学成分和活性。 ⑵ 促使组织凝固、硬化，保持一定的形状、 体积。 ⑶ 增加媒染作用，便于染色；增加折光率， 便于观察。 ⑷ 杀死活细胞或活组织，以进行组织化学反 应。由于固定的上述目的要求，许多良好 的组织学固定液，却不能用于组织化学标 本，特别是酶组织化学标本和免疫组织化 学标本。 2．固定剂的选择 用于组织化学的固定剂有很多种，一 般可分为单纯固定剂和混合固定剂两大类。 所有的组织化学标本固定必须根据其性质及 所进行的组织化学反应选择适当的固定剂。 常用组织化学固定剂举例如下： ⑴ 醛类固定剂：甲醛、戊二醛；中性 福尔马林，多聚甲醛等。 ⑵ 非醛类：丙酮、酒精、Zenker’s液 和Carnoy氏液等等。 应用固定剂时应查阅有关的文献资 料，对前人未做的方法应慎用。固 定剂穿透组织的速率有很大特异性， 不同的固定液其穿透组织速率可有明 显的不同（穿透因子不同）： t = k·de [t=时间；d=组织深度； k、e为穿透因子（常数）] 3． 固定的方法 ⑴ 原位固定法 原位固定法是在保持动物对其器官组织血液供应的条件下，边解剖边向所取样本的部位滴加预冷的固定液的一种方法。这种方法有益于组织细胞酶活性和结构的保存，不足之处是对动物刺激时间较长，因此应快速取样，断头处死动物。 ⑵??浸透固定法 浸透固定法是将组织块浸泡在固定液内而固定的一种方法。在组织化学样品的处理上，对浸透的时间、温度有一定的要求，特别是免疫组织化学样品的要求更严一些。 ⑶ 灌流故定法 灌流故定法是通过血管的途径，将固定液灌注到所要固定的器官组织内，将生活的细胞在原位及时的固定后，在摘取样品的方法。这种方法的特点是：快速、固定充分，但是对固定液的温度、压力及取材时间有严格的要求。 ⑷ 培养细胞和外周血细胞固定法 培养细胞核外周血细胞的固定方法比较特殊，对培养细胞通常取盖片入37℃的 Hanks液中，漂洗两次(每次3—5min)，洗除血清后，再置于甲醛缓冲固定液内10—30min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛固定或采取双重固定法。 外周血通常采用涂片，以甲醛缓冲固定液固定。电镜酶组化则须离心沉淀后，用戊二醛固定（具体法见第4，5，6章）。 4． 固定后的处理——漂洗 已固定的组织样品，在切片之前必须进行漂洗，其主要目的是洗去组织中存余的固定液。这样做有助于酶活性的提高，可避免样品下一步和其它液相的液体接触，引