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实验六 现代免疫学检测技术： ELISA 1.了解ELISA的原理及其优点， 2.掌握试剂盒的使用。 3.学习ELISA的实验操作过程及其应用。 免疫酶技术 （酶免疫测定法） 免疫酶技术:将抗原抗体反应的特异性，与酶反应的敏感性相结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体（或抗原，抗抗体）联结，形成酶标抗体（抗原，抗抗体），其与相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物的颜色反应进行抗原（抗体）的定性和定量（酶标测定仪），亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。 目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA）。 1．乙肝病毒表面抗体(HBsAb)诊断试剂盒。 预包被微孔条（包被纯化HBsAg） 酶结合物：辣根过氧化物酶标记HBsAg （ HBsAg-HRP ） 抗HBs阳性对照 抗HBs阴性对照 洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释，按说明) 底物A（ H2O2 ）、底物B（四甲基联苯胺TMB）和终止液（HCl及2 mol/L H2SO4）。 2．乙肝病毒表面抗原(HBsAg)诊断试剂盒。 　预包被微孔条（包被纯化HBsAb） 　酶结合物：辣根过氧化物酶标记HBsAb （ HBsAb-HRP ） 　 HBsAg阳性对照血清 　 HBsAg阴性对照血清 　洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀，按说明) 　底物A、B和终止液。 3．微量加样器，吸水纸等。 【注意事项】 　　1．试剂盒应于4℃存放，在有效期内使用。 　　2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡至潮气尽干后方可开封启用，余者及时封存。 　　3．滴加试剂前应将瓶摇匀，使液体混匀。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确，注意勿将试剂滴在孔壁上。 　　4．洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。 　　5．待测标本不可用NaN3防腐。所有样品都应按传染源处理。 临床ELISA测定中可能会出现的问题及可能的原因?（非试剂盒本身的原因）? 1．弱阳性样本检测不出??温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题?。 2．测定的重复性差??（相同样本两次测定结果不一致）?这是典型的由测定操作引起的问题，包括?（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；?（2）加样过快，孔间发生污染；?（3）加错样本；?（4）加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；?（5）不同批号试剂盒中组分混用； （6）温育时间、洗板、显色时间不一致；?（7）孔内污染杂物；?（8）酶标仪滤光片不正确；?（9）血清标本未完全凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血细胞，易出现假阳性反应等。 3．白板?（阳性对照不显色）??（1）漏加酶结合物；?（2）洗板液配制中出现问题，如量筒不干净，含酶抑制物（如叠氮钠）等。?（3）漏加显色剂A或B；?（4）终止剂当显色剂使用。? 4．全部板孔均有显色??（1）洗板不干净；? （2）显色液变质；? （3）加底物的吸光受酶污染；? （4）洗板液受酶等污染。 * 一、实验目的 二、实验原理 ELISA简介 1971年瑞典学者 Engvall 和Perlmann，荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（ELISA—enzyme-linked immunosorbent assay） ELISA基本的实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化。 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定。 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色。 ELISA：根据检测目的和操作步骤不向，有以下三种类型的常用方法。 酶联免疫吸附实验 间接法 双抗夹心法 竟争法 双抗体夹心法 双抗原夹心法 (1) 包被固相抗体（室温放置，厂家完成） (2) 加入待检样品（抗原） 抗体 抗原 ELISA检测—双抗体夹心法（测抗原） 放大的反应小孔 酶标抗体 (4) 加入酶反应底物后显色 （ HRP酶与底物反应后,显兰色） 底物 (3)加入酶标抗体试剂 （夹心饼干形成!） ELISA检测—双抗体夹心法（测抗原） ELISA检测—双抗原夹心法（测抗体） 与双抗体夹心法区别： （1）包被抗原 （2）检测样品待测抗体，如血清等。 （3）酶标抗原 酶标板 酶标仪 三、实验内容 1.采用双抗原夹心法,测定乙型肝炎表面抗体（HBsAb）,学习乙型肝炎表面抗体诊断试剂盒的使用方法。 2