2013第三章基因的克隆与分离.ppt

第三章 基因的克隆与分离 目的基因的定义 第四章 目的基因获取 第一节 直接分离法 第四章 目的基因获取 ① 载体的制备； ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取； ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤ 重组克隆的挑取和保存。 文库的代表性和随机性 文库的质量检测 亚基因组文库 指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合，一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆等）。 cDNA文库的构建 1、cDNA文库的特征 1）基因表达的时空性决定cDNA文库的取材， 构建cDNA文库时最好选取目的基因表达量最高的 发育时期或这一时期的特殊组织。 2）表达量的差异决定构建cDNA文库要具有合适的容量。 3)mRNA的丰度 高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总mRNA的22% 中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总mRNA的49% 低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总mRNA的29% 2、均一化cDNA文库 通过一定的策略和方法，将构建好的独立cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致，这种cDNA文库称均一化cDNA文库。 获得目的基因的其他方法 ㈠ 构建差示文库筛选特殊基因 差示文库（differential library）又称扣除文库（ subtracted library）, 是反映不同组织细胞或同一种细胞在不同生理状态下,基因表达差异的cDNA文库。 ㈡ mRNA差异显示法获得目的基因 mRNA差异显示（mRNA differential display DD）PCR法全称为DD-PCR法其用途和应用目的与构建差示文库大体一致。 ㈢ 基因改造可获得新型目的基因 采用基因拼接、基因缺失或点突变等方法，使表达产物量提高或降低毒性，有助于研究基因间的相互作用（如协同／抑制效应）。 第二节??????? 获得目的基因方法的选择 一、根据获得目的基因的研究目的选择方法 为了研究基因全长结构、调控、DNA信息分析 构建基因组文库， 为了开展目的基因重组表达 制药、治疗 构建cDNA文库。 若目的基因序列明确可设计引物通过PCR/RT-PCR克隆。 若目的基因序列短小可化学合成。 二、根据目的基因本身特点选择方法 对从基因组中克隆的基因(内含子) 只能真核表达 对从cDNA中克隆的基因(无内含子) 可在原核/真核表达 要选择mRNA表达丰富的组织材料，PCR克隆的基因必须测序。 三、根据实验室设备条件选择方法 部分文库无需自行构建，有商品出售。 目的基因序列明确，也无需建库，可直接用PCR/RT-PCR克隆。 第四章 目的基因获取 一 利用ncbi有哪些信誉好的足球投注网站不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列 因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。 二、对所找到的序列进行多序列比对 将有哪些信誉好的足球投注网站到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可选工具有Clustal W，也可在线分析http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 。 三、确定合适的保守区域 设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～ 400个aa为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个aa残基，因为每条引物至少18bp左右。若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个aa的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是有两个6个aa且两者间距离合适的保守区域。 四、利用软件设计引物 当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，其中pp5支持简并引物的设计，将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条