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第16章 核酸的研究方法 第一节  核酸的分离、提纯和定量测定 核酸制备的原则 核酸制备中共同需要注意的问题是防止核酸的降解和变性，要制备天然状态的核酸，必须采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用。 一、DNA的分离 1. 浓盐法： 二、RNA的分离 制备RNA通常需要注意3点： ①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性。 ②在破碎细胞的同时加入强变性剂(如胍盐)使RNase失活。 ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂(如RNasin)。 常用的制备RNA方法 （1）不同功能RNA常分布于细胞的不同部位，分离这些RNA常需先用差速离心法，将细胞核、线粒体、叶绿体、胞质体等各部分分开，再从这些部分中分离出RNA。 （2）分离方法：用异硫氰酸胍／苯酚／氯仿抽提。 （3）分离poly(A) mRNA通常采用寡聚胸腺嘧啶核苷酸(oligo(dT))亲和层析法 三、核酸含量的测定法 1.紫外分光光度法（260nm） 2.定磷法 先用浓硫酸或过氯酸将有机磷水解成无机磷。在酸性条件下磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝（660nm），通过测定磷含量计算出核酸含量 3.定糖法 （1）当RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与甲基苯二酚(地衣酚)反应呈鲜绿色（670nm），反应需要三氯化铁作催化剂 （2）DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595 nm处 第二节 核酸的凝胶电泳 常用的凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。 一、琼脂糖凝胶电泳 常用于分析DNA和RNA。由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶杂质，所以用于分析RNA时，必须加入蛋白质变性剂，如甲醛等 ； 电泳完毕后，将胶在荧光染料溴化乙锭的水溶液中染色 ；经紫外光照射可发射出红橙色荧光 琼脂糖凝胶电泳的应用 1. 可以确定是否存在核酸物质。 2.可以近似测定DNA片段的分子大小和含量 3.凝胶上的样品可以回收，以供进一步研究 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶的孔径比琼脂糖胶要小，所以可用于分析相对分子质量小于1 000 bp的DNA片段和RNA的电泳。 聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，用于RNA的分析不会分解样品 第三节 核酸的核苷酸序列测定 一、酶法测序 Sanger于1975年设计，又称为“加减法” 工作原理： 1977年Sanger又提出了 “终止法” 共分4组，每组按一定比例加入一种2’，3’双脱氧核苷三磷酸；能随机掺入合成的DNA链，一旦掺入DNA合成即终止 ；经变性胶电泳，可从自显影图谱上直接读出DNA序列 二、DNA的化学法测序 化学法测序由Maxam和Gilbert于1977年所发明。 基本原理：用特异的化学试剂作用于DNA分子中不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，就可以使末端标记的DNA分子切成不同长度的片段，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 4组特异的反应如下： (1) G反应 用硫酸二甲酯使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在该处断裂。 (2) G+A反应 用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂。 (3) T+C反应 用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基。 (4) C反应 当有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。哌啶促使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂。 第四节  DNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction; PCR) 聚合酶链式反应(PCR)是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。该反应是一指数式反应，其可在短时间内使目的片段的扩增量达到106倍，可从极微量的DNA乃至单细胞含有的DNA起始，扩增出ug级的PCR产物。 自20世纪80年代中期PCR技术问世以来，迅速渗透到了分子生物学的各个领域，现已在基因克隆、外源基因的整合检测、物种起源、生物进化等方面得到了广泛应用。 PCR原理 在模板DNA、引物、4种脱氧核糖核苷酸和Mg2+存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，是通过3个步骤完成的反复循环。 3步反应：变性、退火、延伸 * SDS-浓盐buffer破碎细胞 离心，取上清 加水，使DNP沉淀 酚/氯仿去蛋白