基因的克隆方法.ppt

前言 一、 基于基因产物的基因克隆方法 原理：根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后设计探针或引物从基因组文库或cDNA文库中分离出相应的基因。 ? 差减杂交（SH） ? 抑制性差减杂交（SSH） ? 差异显示PCR（DD RT-PCR） ? DNA代表性差异分析（DNA RDA） ? 扩增限制性片段长度多样性（AFLP） ? cDNA微阵列 ? 基因突变体的研究：如基因的表达与不表达； ? 基因时空表达的研究：如根、茎、叶； ? 不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。 1.2.2 抑制性差减杂交（SSH） 应用 基因突变体的研究：如基因的表达与不表达 基因时空表达的研究：如根、茎、叶 不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照 1.2.3 差异显示PCR（DD RT-PCR） 最先由Liang等于1992年报道，目前已广泛在实验室使用。 主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。 具体操作： 1、提取mRNA； 2、特定引物（12分之一）反转录； 3、特定引物和RP结合RT-PCR； 4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较DNA带，从而找出差别DNA。 缺点： 假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。 工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。 优点： 简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。 所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进行比较。 扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。 二、基于基因加标签的基因克隆方法 原理：主要是在生物基因组中插入外源的一段DNA，使生物体产生某种突变表型，然后反过来利用这段外源已知的DNA片段来克隆基因的方法。 ? T-DNA标签法克隆基因技术路线： 农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。 建立突变体基因组文库及野生型基因组文库. 用T-DNA片段做probe筛选突变体文库，获得阳性克隆。 用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。 把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。 转座子标签法 转座子又称转座因子或者跳跃因子，实际上也是DNA片段，它可以在生物的染色体组中移动，从染色体的一个位点跳到另一个位点，或从一条染色体跳到另一条染色体上，引起基因功能的改变。 转座子标签法 最早是美国玉米育种家1951年发现，起初不被认同，1967年在大肠杆菌的半乳糖操纵子中证实后得到认同。 根据DNA的结构和转座的机理，分为两大家族：转座子和逆转座子，前者如玉米的Ac/Ds系统和spm因子，后者如果蝇的copia因子。 转座子根据结构不同可以分为简单转座子和复杂转座子 简单转座子：可以直接插入到其他位置,也叫插入序列。 复杂转座子：携带有其它基因或遗传标记。 结构共同点： 两端含有20-40个核苷酸的倒置重复序列。 含有可编码转座酶的基因。 应用：以Ac/Ds系统为例 Ac/Ds系统操作原理 把Ac，Ds分别转化并获得转化体。 把Ac转化体同Ds转化体进行杂交得到F1代，然后自交得到F2、F3代分离群体，找出稳定突变个体。 用Ds做probe筛选突变体文库获得突变基因的部分序列。 用上述序列筛选正常个体基因组文库或cDNA文库，得到目的基因。 三、 基于基因序列的基因克隆方法 4 、基于基因图谱的基因克隆方法 ?又称图位克隆法，是建立在拥有RFLP等分子标记的连锁遗传图和基因文库，基因产物未知的一种基因克隆技术，理论上可以分离任何一个突变基因。 图位克隆基因的一般操作过程： ?通过遗传分析构建与目标基因紧密连锁的分子标记连锁图，达到基因的精细定位。 ?用与目标基因紧密连锁的两侧分子标记筛选基因组文库，构建包含目标基因的基因组物理图谱。 ?通过染色体步移或染色体登陆技术对目标基因进行进一步精细定位，得到阳性克隆。 ?对阳性克隆转化隐性受体进行功能互补。 ?基因序列测定及表达分析等。 影响基因图位克隆的因素： 建立的分子标记遗传图中标记与基因之间的距离大小。 基因组的大小及可能存在的大量的重复序列。 基因组文库的大小及单克隆的大小。 成功的例子： 水稻Xa21 拟南芥的RPM1，RPS2等。 图位克隆基因需满足的条件： 较理想的遗传图谱和物理图谱，如SSR、RFLP图谱。 大片段的基因组文库（BAC ，PAC ，TAC等）。 遗传转化技术。 其它的基因克隆法 cDNA捕捉法 RNA