细胞工程的理论基础13803.ppt

动物细胞与组织培养（cell and tissue culture）是动物细胞工程的重要技术基础。 动物的细胞与组织培养是指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。 组织培养的概念 组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。 A：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。 B：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。 从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细胞培养。 C：器官培养：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。 生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹 症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白 细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。 科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。 临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾 病的治疗等 体外细胞培养物的生长类型 按生长方式:2型 粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 体外培养细胞的分型  贴附(粘附)型细胞 粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式 含义 两方面 结果 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 才能生存和生长。 悬浮生长型 概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源 自血，脾或骨髓， 尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能 特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形，单个或小细胞团 悬浮型 概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 　　　易于收获，可获得稳定状态 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细 　　　胞) 游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。 吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。 潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。 停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 原代培养 直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。 优点： 组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。 传代 将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养 原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3．贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。 常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 首次传代注意事项 细胞生长密度不高时，不能急于传代 原代培养的贴壁细胞需控制消化时间 吹打已消化的细胞应减少机械损伤 首次传代时细胞接种数量要多一些 首次传代培养的pH应偏低些 小牛血清浓度可加大至15%～20%左右 细胞计数 计数结果以每毫升细胞数表示 细胞计数的原理和方法与血细胞计