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实验六细胞的原代和传代培养 实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本原理和操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。 实验用品 一、材料和标本 乳鼠、HeLa细胞（人宫颈癌细胞） 二、器材和仪器 手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管（灭菌后备用）、酒精灯、烧坏、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。 三、试剂 含有5%小牛血清的MEM培养液、0.01mo1／L PBS，0.25%胰蛋白酶／0.02%EDTA混合消化液、75%乙醇。 实验内容 一、原代细胞培养 (一)原理 细胞培养（Cell culture）是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。 原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。 实验方法 单层细胞培养法 酶消化组织使其分离成单个细胞或较小细胞团，接种培养。 组织块培养法 把组织小块（0.5－1mm3）直接贴附培养瓶壁，细胞自组织块边缘向外长出生长晕，最后连接成片形成单层细胞。 本次实验采用组织块培养法。 操作步骤 1．取材 颈椎脱位法使乳鼠迅速死亡，把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏，置于无菌平皿中。 2．切割 Hanks液清洗，移入青霉素小瓶或表面皿上，眼科手术剪刀将组织反复剪碎，直到成 0.5－l mm3左右的小块，再用吸管加入2－3滴细胞培养液，使组织块悬浮在培养液中。 3．接种 用吸管分次吸取组织块悬液，将其均匀分布在培养瓶底壁上，翻转培养瓶，加入2－3ml培养液，盖好，做好标记，二氧化碳培养箱中培养。2－3h后，组织块牢固贴壁，缓慢翻转培养瓶，使培养液浸泡组织块，继续培养。 4．观察 组织块静止培养2－3d后，每天小心取出观察。注意有无污染，贴壁组织块边缘有无细胞长出。另外，根据培养液颜色变化，补加或更换培养液，除去悬浮的组织块。 一般细胞生长良好，约10－15天长成致密单层，这时可以传代培养。 二、传代细胞培养 （了解） （一）原理 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 操作步骤 1. 将细胞悬浮 2. 离心 3. 稀释至理想密度 4. 传代培养 作业 一、原代细胞培养方法有哪些，主要步骤？ 二、总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。 * * *