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第一章 分子生物学基本理论 一、半保留复制及转录、逆转录 (1)DNA的半保留复制(semiconservative replication) DNA是所有原核生物和真核生物遗传的主要物质基础。在这些生物中遗传信息以遗传密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序,并通过DNA复制(replication)由亲代传给子代。在DNA合成进行时，以两条亲代DNA链中的每一条链为模板，在DNA指导下的DNA聚合酶催化下，按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制。由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链，所以DNA的这种合成作用又称半保留复制(图1)。 图1 (2)RNA的转录（transcription）以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription）。转录是生物界RNA合成的主要方式，是遗传信息DNA向RNA传递过程，也是基因表达的开始。转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polynerase ,DDRP）。转录产生初级转录物为RNA前体（RNA precursor），它们必须经过加工过程变为成熟的RNA，才能表现其生物活性。RNA的转录合成从化学角度来讲类似于DNA的复制，多核苷酸链的合成都是以5’→3’的方向，在3’-OH末端与加入的核苷酸磷酸二酯键，但是，由于复制和转录的目的不同，转录又具有其特点：（1）对于一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，而且每个基因的转录都受到相对独立的控制；（2）转录是不对称的。（3）转录时不需要引物，而且RNA链的合成是连续的。转录的主要过程分为识别与起始、延长和终止三个阶段。 (3)RNA的逆转录（transcription）以RNA为板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序(其中与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做转录酶(reverse transcriptase)。大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程。②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子。除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性。反转录酶的发现对于工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。 ②模板DNA与引物的退火(复性) 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸 DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性－退火－延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”,这种新链又可成为下次循环的模板，每完成一个循环需2－4分钟，2－3个小时就能将待扩目标基因扩增放大几百万倍 。 PCR在1983年发明之后，由于PCR的操作过程中，需要反复加热变性与降温复性的步骤，而前一次扩增循环所使用的大肠杆菌DNA聚合酶在下一个扩增循环的高温下就变性了，因此在每一次冷热循环之后都要加入新鲜的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I的klenow片段。其缺点是该酶不耐高温，90℃会变性失活；后来，Mullis等在美国黄石国家公园温泉内分离得到了嗜热菌株。1986年6月，Saiki首次将从嗜热菌分离纯化得的TaqDNA聚合酶应用到PCR中，效果相当好。TaqDNA聚合酶不但大大简化了PCR工作，同时专一性及活性都比之前使用的酶更强。 二、PCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+—30bp为宜，常用为20bp左右。 （2）引物扩增跨度（扩增片段长短）：扩增片段在普通PCR以200—500bp为宜，而实时荧光PCR则为50—150bp。 （3）引物内部的二级结构：引物内部应避免出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补。 （4）引物的G+C比例及碱基：G+C含量以40%-60%为宜，G+C比例太低扩增效果不佳，G+C比例太高易出现非特异条带。 （5）引物的Tm值：理想的引物的Tm值应在55-60℃。引物对之间的Tm值差异不应超过2-3℃.引物的Tm值计算可按以下公式计算：Tm=2(A+T)+4(G+C) (6) 引物量： 引物浓度过高则导致错配和非特异性扩增，