荒漠草原土壤微生物16SrDNA扩增反应条件的优化.pdfVIP

第 38卷 第 2期 内蒙古师范大学学报 (自然科 学汉文版) Vo1．38No．2 2009年 3月 JournalofInnerMongoliaNormalUniversity(NaturalScienceEdition) M ar．2009 荒漠草原土壤微生物 16SrDNA扩增反应条件的优化 卢 萍，吴永胜，李 浩，马万里，孙 润 (内蒙古师范大学 生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010022) 摘 要 ：以荒漠草 原土壤 微生物总 DNA为材料 ，分 析模板 DNA 量、Mg”、引物和 dNTP 的浓度对 16SrDNA-PCR扩增结果 的影响，经 系统 的优化实验建立 了土壤微生 物 PCR反应 体系：25 L体 系中含 0．1mmol／LdNTP、2．5mmol／LMgC1z、1UTaq酶、0．4#mol／L引物和 4ng的DNA模板． 关键词 ：荒漠草原；土壤微生物 ；16SrDNA；PCR；优化 ；扩增反应 中图分类号：Q948；S812 文献标识码 ：A 文章编号：1001-8735(2009)02-0213-04 荒漠草原是草原向荒漠的过渡状态，广泛分布于内蒙古中西部地区，研究其土壤微生物的群落类型及多 样性可以为探索微生物与草原生态系统 的关系、遏制草原退化奠定基础．对不 同微生物中保守性很强 的 16SrRNA基因进行PCR扩增，并对其产物进行DNA序列分析，能够为生态系统中的微生物组成及其多样 性提供分子系统学研究证据n]．目前对 内蒙古荒漠草原生态系统的研究很少深入到分子水平，为此，本文对 提取的内蒙古荒漠草原土壤微生物总 DNA进行 16SrRNA基 因的扩增 ，并对 PCR反应系统 中的Mg抖、 dNTPs、Taq酶和引物的浓度及 DNA模板量等因素进行优化研究，旨在建立重复性强、稳定性高的反应体 系 ，从而为深人研究荒漠草原土壤微生物的多样性奠定基础． 1 材料与方法 1．1 实验材料 在内蒙古包头市达茂旗、乌兰察布市四子王旗和锡林郭勒盟苏尼特右旗境 内的荒漠草原样地采集 5个 土壤样品，每个样地按梅花形设 5个采样点，用土钻采集混合土壤样品，采集深度为0～2Ocm．将样 品装入灭 菌封 口的聚乙烯袋 ，带 回实验室一80℃低温保存，以备 DNA提取．采样地概况见表 1． 1．2 仪器与试剂 表 1 5个土壤样品的取样地 1O×PCR Reactionbuffer、TaqDNA Polymer— Tab．1 Locationsoffivesoilsamplingsites ase、MgC12、dNTPs、100bpladder等购 自北京天为 时代科技有限公司；细菌通用引物 由上海生物工程 服务有限公司合成 ，序列为：引物 1：5一AGAGTTT— GATCCTGGCTCAG一3，引物 2：5一GGTTACCTT— GTTACGACTT一3． PCR反应在 BiometraT1PCR仪上进行 ，PCR 产物用 TannonGIS一2010凝胶 自动成像系统照相． 1．3 实验方法 1．3．1 土壤微生物的DNA提取 称取2．5g土样，用文献 [8]中经改进优化的原位(insitu)裂解法提取总 收稿 日期：2008—10—08 基金项 目：国家 自然科学基金资助项 目；留学回国人员科研启动基金项 目(2005)；内蒙古 自治区高等学校科研基金项 目 (NJ05099) 作者简介 ：卢 ~(1964一)，女(蒙古族)，内蒙古海拉尔人，内蒙古师范大学副教授，博士，主要从事遗传与分子生物学 、 分子生态学、牧草 种质资源学研究 ，E-mail：luping@imnu．edu．cn． · 214 · 内蒙古师范大学学报 (自然科学汉文版) 第 38卷 DNA，DNA用含EB的1．O 琼脂糖凝胶进行 电泳检测