第一章土壤中拮抗芽孢杆菌的分离筛选鉴定.doc

第一章 土壤中拮抗菌的分离筛选鉴定在植物根际存在的大量的微生物中，细菌的种类最多，数量也最大 (Glick,1995)。现有23个属的细菌被发现有生防潜力，且应用于多种作物的生物防治 (郭荣君，1996)。为了扩大生物防治制剂的种类，各种拮抗性微生物的筛选和应用仍然在研究中 (孙彩云等，2002)。芽孢杆菌(Bacillus spp.)是自然界广泛存在的一类细菌，其生理特征丰富多样，分布广泛，是土壤和植物根际的重要微生物种群。可产生抗生素Asaka O，1996；Kleinkauf H，1990）、细菌素Zheng G，1999）、细胞壁降解酶类和其它抗菌蛋白Axe1 G，1999）等十几种抗菌物质，在植物病害生物防治中被广泛应用（刘焕利，1999彭清忠。孔建等（1999）报道了枯草芽孢杆菌B-903对棉枯萎病等多种土传镰刀菌和苹果轮纹病等具有抑菌活性，并通过试验证明用B-903菌液浸种可显著降低棉炭疽病等棉苗病害和菠菜枯萎病，防效分别可达51.7%-69.4%和68.1%-76.2%。晏立英等（2005）从油菜根际或叶围分离得到的枯草芽孢杆菌Yl菌株，对油菜菌核病菌菌丝的生长具有明显的抑制作用；在温室盆栽试验和田间小区试验中，该菌株对油菜菌核病的防效达到92％。芽孢杆菌能产生耐热抗逆的芽孢，这有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。 本章针对由尖孢镰刀菌引起的作物枯萎病，对福建、浙江、四川、新疆等地的农田和自然保护区的土壤芽孢杆菌进行了分离和筛选，旨在获取优良的原始拮抗菌株，为进一步的应用及机理研究奠定基础。 目前对植物病害拮抗菌的室内筛选大部分是沿用对峙培养法和纸碟法，方法所筛选的菌株主要是通过产生抗生素起作用。实际上与生防有关的性状很多，如在根际的定殖能力以及对不同环境的适应能力等。近年来分子生物学技术在菌株筛选中的应用使提高筛选效率成为可能，并提供了菌株筛选的新标准（抗生素产生相关基因的存在与否），但不够简便，推广受限。许多通过营养和空间位点竞争起作用的生防菌株，通常需要经过温室和田间试验才能被筛选到，筛选周期长且需要投入大量的人力、物力。因此，在进行拮抗细菌的室内初筛试验时，我们仍采用了平板对峙培养法，继而接合盆栽试验筛选理想的生防细菌。 材料与方法 1.1.1 供试材料 土壤来源：从浙江、新疆、四川九寨沟、福建省各地枯萎病发生田、福州鼓山等不同地区不同生态环境植物根际采用对角线五点式采样法采集土样。采样时，先刮去表层土，挖取5-20cm深度的土壤，将五个采集点样品混合均匀后取适量装入采样袋，写明标签。带回实验室后，将土样风干，过筛后用于分离土壤芽孢杆菌。 番茄枯萎病菌Fusaium. oxysporum f. sp. radicis lycopersici ZJUF20031菌株，由浙江大学章初龙老师惠赠。1.1.2 培养基 NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂18g，水1000ml，pH7.0-7.2，液体培养基不加琼脂。PSA培养基：马铃薯200 g，蔗糖20g，琼脂17 g，蒸馏水1000 ml。TSB琼脂培养基购自BD公司 1.1.3 仪器试剂 Agilent Chromatograph: GC）气相色谱系统，包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；分析软件应用美国MIDI公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的软件MIS4.5（Microbial Identification System）和 LGS4.5（Library Generation Software）。脂肪酸甲酯混合物标样、脂肪酸提取所需试剂（皂化试剂、甲基化试剂、萃取试剂和洗涤试剂）均由MIDI公司提供；PCR产物纯化试剂盒购买于上海生工；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；Wizard PCR产物纯化试剂盒购自Promega公司；其余试剂均为国产分析纯。1.1.4土样的采集及芽孢杆菌的分离 从各采集地植物根际采集土壤样本120份，风干、过筛后，准确称取土壤10g放入装有90 ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分振荡，静置30s后即为10-1土壤稀释液，吸取lml加入到9ml的无菌水中，混匀即为10-2土壤稀释液，依次类推，可制备10-3、10-4、10-5等稀释液。从每个梯度稀释液吸取0.lml接种在NA培养基上，用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂抹均匀，每个梯度设3个重复。涂抹好的平板平放于桌上静置20-30min后，置于30℃恒温箱培养72h，根据菌落颜色、形态、干湿、高度、透明度、边缘等特征挑取有代表性的单菌落，涂片镜检，选取芽孢杆菌转入NA斜面培养基保存，作为待测菌株。 1. 拮抗细菌的筛选 1. 平板对峙培养法 在培养4天的番茄枯萎病菌的菌落边缘打取直径为6mm的菌块，将其