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丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂耐药性的分子基础 From：Keith P. Romano, Akbar Ali, Cihan Aydin, Djade Soumana, Aysegul Ozen, Laura M. Deveau, Casey Silver, Hong Cao, Alicia Newton, Christos J. Petropoulos, Wei Huang, Celia A. Schiffer. PLoS Pathogens.July 2012, Volume 8 ,Issue 7. 丙型肝炎病毒(HCV)感染了全世界超过1.7亿人,是导致慢性肝脏疾病的主要原因,包括肝硬化、肝衰竭,和肝癌。虽然现在包括boceprevir和telaprevir(抑制病毒NS3/4A蛋白酶)在内的联合治疗方案的效果比较显著，但这些抗病毒治疗能够引起严重的副作用,而且仅对一部分病人有效。尽管科学家为研究新一代蛋白酶抑制剂进行了广泛的努力，但是此类药物的长期有效性仍然受到了迅速出现的耐药现象的极大挑战。在蛋白酶上的R155、A156和D168氨基酸残基的单位点突变赋予了其对几乎所有的用于临床的蛋白酶抑制剂的耐药性。因此，开发下一代能够保留更广谱的活性、并且对抗药物抗病毒的变种的药物，需要全面地了解耐药性的分子基础。在这项研究中，四种代表性的蛋白酶抑制剂——telaprevir、danoprevir、vaniprevir和MK-5172分别与野生型蛋白酶以及三种主要的耐药变异体R155K、A156T和D168A形成复合物，得到16个高分辨率的晶体结构模型，揭示了它们抵抗每种药物的独特的分子基础。在酶与抗病毒的检测中，这些药物对不同的蛋白酶变体显示出不同的敏感性。Telaprevir、anoprevir和vaniprevir直接与产生耐药性的突变位点作用，而MK-5127则是通过一个独特的三联催化作用进行作用。MK-5127这种新颖的交联模型能够解释它为什么对R155K和D168A这两种多药物耐药变体仍有一定效力。这些发现解释了HCV N3/4A蛋白酶抑制剂耐药性的分子基础，并且为设计针对快速变异的病毒的更有效的治疗方案提供了潜在的策略。 Introduction …… Results 药物敏感性检测 为了测定telaprevir、danoprevir、vaniprevir和MK -5172分别对野生型基因型1a的HCV以及耐药变异体R155K、A156T和D168A的药物活性，使用了病毒复制为基础的抑制实验。随着亲合结合力的变化，这些药物对耐药性变异体抗病毒活性的变化趋势通过酶抑制实验被测定(表一)。对野生型蛋白酶，大环抑制剂如danoprevir、vaniprevir和MK -5172分别在纳摩级范围内表现出抗病毒的效力（IC50 = 0.24 nM 、0.34 nM和0.11 nM），而telaprevir的效力显着降低（IC50 = 1030nM），符合与以前的报告。相对于野生型，danoprevir和vaniprevir对R155K的效力大大减少，但MK -5172保持高度活性（R155K IC50 = 0.55 nM）。与野生型相比，telaprevir的效力对D168A相对稍微好一点，而MK -5172、danoprevir和vaniprevir对D168A失去100 - 1000倍的效力。然而，danoprevir和MK -5172对D168A的活性比telaprevir更好。在这些大环药物中，与vaniprevir相比，danoprevir和MK -5172保留着对D168A更高的活性（D168A IC50分别为 48nM和13 nM）。Danoprevir还保留了对A156T的显着更高的效能（ A156T IC50 = 5.7nM），??而其他三种药物产生大倍的效能损失。值得一提的是， MK -5172 ，虽然对另外两个变种有效，但对A156T失去了显着的效力（A156T IC50 = 108nM）。因此，四个药物表现出不同蛋白酶抑制剂耐药病毒变异（R155K、D168A和A156T）的敏感性。 Structure determination and analyses 为了阐明化学性质不同的抑制剂结合野生型蛋白酶和耐药变种的根本机制，16个抑制剂-蛋白酶复合物的晶体结构被确定。这些复合物包括野生型蛋白酶和耐药变种R155K、D168A和A156T，分别与telaprevir、danoprevir、vaniprevir和MK -5172结合，分辨率为1.10-2.50 埃（表2）；S139A蛋白酶变体没有用于telaprevir，因为其需要与139位丝氨酸形成有效结合的共价键。这些高分辨率的数据提供了药物-蛋