医学遗传学实验技术1.doc

医学分子遗传学实验技术 陈丙玺 郭辰虹 编 龚瑶琴 审 山东大学医学院医学遗传学研究所 2002.10. 目 录 实验一 全血细胞DNA的快速提取 ………………………………1 实验二 组织细胞DNA的提取 ……………………………………3 实验三 全血细胞总RNA 快速提取（一步法）……………6 实验四 核酸浓度及纯度测定 ………………………………8 实验五 基因组DNA的限制性内切酶酶解…………………12 实验六 琼脂糖凝胶电泳分离酶解的DNA片段……………15 实验七 Southern印迹法 …………………………………18 实验八 聚合酶链反应（ＰＣＲ） 实验九 聚丙烯酰胺凝胶电泳………………………………28 实验十 限制性片段长度多态性(RFLP)分析………………35 实验十一 短串联重复序列（STR）的多态性分析 ………38 实验十二 单链构象多态性（SSCP）的检测………………45 附 录…………………………………………………50 一、常用电泳缓冲液 ………………………………………50 二、常用上样缓冲液 ………………………………………50 三、常用DNA片段标记物 …………………………………51 四、Low DNA Mass Lader …………………………………51 五、常用小分子DNA片段标记物 …………………………52 六、Tris-Cl缓冲液pH值与温度的关系…………………53 七、常用计量单位…………………………………………53 八、常用核酸蛋白质常数 …………………………………54 九、三磷酸核苷酸的物理常数及摩尔浓度 ………………55 十、常用试剂贮存液的配制 ………………………………56 十一、核酸的浓缩 …………………………………………59 十二、有潜在危险的材料与试剂的安全使用 ……………61 [目 的] 初步掌握人类基因组DNA的提取方法。 了解DNA 提取的原理。 [原 理] 人类基因组DNA在细胞核中与组蛋白结合形成染色质(分裂中期为染色体)。因此，提取DNA时必须除去与DNA分子结合的组蛋白及其它细胞成份，并尽可能地保持DAN分子的完整性。DNA提取的主要原理是利用SDS(十二烷基磺酸钠)的离子型表面活性作用—溶解膜蛋白、破坏细胞膜和核膜。SDS使细胞中的核蛋白解聚并与蛋白质结合、最终使蛋白质变性。反应体系中的SDS和EDTA还可抑制DNA酶活性，防止DNA分子降解。经SDS破坏的细胞膜、核膜及其它细胞成份，可通过苯酚抽提或经蛋白沉淀剂（如醋酸铵）沉淀后从反应体系中除去。最后在高盐条件下，用异丙醇或预冷的无水乙醇将DNA分子沉淀析出。 [器材与试剂] 一、器材 １．台式高速离心机（最大转速16000转/分） ２．1.5ml Eppendorf（Ep）管 ３．P～200,P～1000 精密进样器 ４．吸头 ５．2.5ml一次性注射器及静脉抽血用消毒棉球、止血带、镊子等 ６．刻度吸管(2ml, 5ml) 二、材料 人外周静脉血 三、试剂 1．ACD抗凝剂(见附录) 2．红细胞裂解液：内含NH4Cl, EDTA-Na2和NaHCO3等 3．白细胞裂解液：内含Tris,EDTA-Na2和SDS等 4．蛋白沉淀液：内含NH4Ac等 5．1×TE(见附录) 6．无水乙醇：-20℃贮存备用 7．70%乙醇：-20℃贮存备用 [实验步骤] 1．常规抽取外周静脉血2ml,加ACD抗凝剂0.1～0.2ml，混合均匀。血液标本要新鲜，在2～8℃冰箱内存放不要超过5天，以保证DNA分子的完整。 2．加300μl抗凝血于1.5ml Ep 管中。加入900μl红细胞裂解液，反复颠倒混合均匀，室温下放置10分钟，其间再颠倒3～5次。 3．室温下15000rpm 离心20秒，使有核细胞沉淀于Ep 管底部。 4．吸去上清液，加红细胞裂解液900μl，混合均匀，重复离心一次。留取30μl上清液与沉淀的白细胞混合成细胞悬液。若血红蛋白沉淀较多，可再次用红细胞裂解液洗涤，再离心吸去上清液。留取 30μl上清液将沉淀的白细胞混合成细胞悬液。 5．加300μl白细胞裂解液，充分混合均匀。室温放置10～15分钟，(也可放置更长时间)直至白细胞完全裂解（溶液变的粘稠）。 6．加100μl 蛋白沉淀液，强力震荡使之充分混合均匀。 7．15000rpm 离心3分钟，蛋白质沉淀在Ep 管底部形成紧密的深棕色斑块。 8．将上清液转移至另一新的1.5ml Ep 管中，加入900μl预冷的无水乙醇 ，放置冰上2～3分钟，然后反复轻轻颠倒Ep 管，直至DNA沉淀完全析出。 9．用自制的玻璃钩取出沉淀的DNA团块，使其在管壁上停留片刻以除去多余的液体。