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Order：010 Tech Tech QQ：328153626 pBLUE-T Quick Ligation Kit pBLUE-T载体快速试剂盒 目录号：试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 20次 60次 20次 60次 pBLUE-T Vector(30ng/(l) 20(l 60(l 20(l 60(l 1000bp Control（30ng/(l） 5(l 5(l 5(l 5(l 10 ( PEG Enhancer 50(l 150(l 50(l 150(l 10 x Ligation Buffer 40(l 120(l 2 ( Quick Ligation Buffer 100(l 300(l T4 DNA ligase, 5U/(l 20(l 60(l －20℃储存个月不影响使用效果。产品介绍： DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3’(末端后都带有一个突出的碱基A，这样的PCR产物可以用3’(末端后带有一个突出碱基T的载体方便地进行克隆。pBLUE-T 载体来源于pBlueScript II SK(+) 质粒，在EcoRI酶切位点处添加了适当序列，经XCM I 酶切后其3’末端直接产生未配对的T碱基而成，因此有更高的重组效率。pBLUE-T 载体插入位点两端独特设计的两个ECOR I位点使插入片段可以用廉价高效的ECOR I单酶切检测； 同时pBLUE-T 载体不含NdeI或NcoI限制性内切酶位点，可方便用于克隆含上述酶切位点的基因。此外，本公司载体连接体系还有背景低（蓝斑小于10%），重组率高（白斑中超过90%有插入片段），可快速连接等特点。本说明书末列出了pBLUE-T 载体相关的技术资料，其全序列可参照pBlueScript II SK(+)序列，只是其多克隆酶切位点处序列稍有不同。 测序可以采用T3、T7启动子引物和M13通用测序引物（见后面图谱） 操作步骤： PCR产物是否要进行纯化取决于扩增产物的质量。如果PCR产物非常干净，不经纯化就可直接进行连接反应。但如果是以质粒为模板的PCR产物则必须进行纯化，模板质粒有可能也形成白斑。PCR产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。本公司生产的DNA产物快速纯化回收试剂盒对70bp以上的DNA片段能很好地进行回收。 Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其末端都带有一个突出的3’ (A。 具有3’ (A末端的PCR产物可以直接用pBLUE-T 载体进行克隆连接。具有3’(5’外切酶活性的DNA聚合酶（高保真酶）扩增的PCR产物是平末端，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先进行3’(端加A工作。 常规连接反应： 在一个标准的10 (l连接反应体系中，加入1 (l 30ng pBLUE-T 载体、X (l PCR产物(在通常状况下，没有必要对PCR产物进行精确定量，一般PCR产物与载体的摩尔比优化至2:1~10:1就可以得到良好结果，推荐3:1)、1(l 10(ligation Buffer和0.5-1(l (2.5 -5 Weiss Units)的T4 DNA Ligase，其余用水补足。反应按以下体系进行： 1(l 10(Ligation Buffer (用前充分融解混匀) 1(l 10 ( PEG Enhancer 1(l pBLUE-T Vector X(l 纯化后的PCR产物/或者1(l 1000bp control Y(l 无菌水 0.5-1(l（5 Weiss Units/(l) T4 DNA Ligase Final Volume 10(l 一般最后加入T4 DNA Ligase。 (l体系标准连接酶量为2.5 Weiss Units即可），可以得到最多的转化子。但是本系统含PEG Enhancer可以提高连接效率数倍，在高连接酶量的情况下（10(l体系推荐连接酶量为5 Weiss Units）16℃连接30分钟即可达一般研究的要求。 冰上冷却，然后转化或贮存于-20℃。 快速连接反应： 反应按以下体系进行： 5(l 2 ( Quick Ligation Buffer (用前充分融解混匀) 1(l pBLUE-T Vector X(l 纯化后的PCR产物/或者1(l 1000bp control Y(l 无菌水 1(l（5 Weiss Un