接枝赖氨酸柔性臂的壳聚糖微球固定葡萄糖氧化酶的研究.pdfVIP

接枝赖氨酸柔性臂的壳聚糖微球固定葡萄糖氧化酶的研究 金挺，周小华，肖燕 重庆大学化学化工学院(400044，重庆) 葡萄糖氧化酶(E．C．1．1．3．4，简称GOD)，专一催化夕～D-葡萄糖加氧生成葡 萄糖酸(简称GCOOH)和H：02，广泛应用于食品、饲料、医药、分析等行业。但游离 的GOD氧化夕一D．葡萄糖，只能使用一次，半衰期短，与游离GOD相比较，固定化 GOD具有可反复使用、可做成反应器连续催化及与反应液易分离等优点。目前，固 定化的载体主要是天然高分子，固定方法中以交联(偶联)方法为佳，但现有的 交联剂烃链短，导致固定化GOD的构象受载体表面基团干扰，催化活性降低。载 体接枝柔性手臂n捌是近年来发展的一种改善固定化酶性质的新方法，即先在固定 化酶载体接枝一定长度的侧链或基团(柔性手臂)，再将酶固定于手臂上。由于接 枝手臂与载体仅单端成键、且手臂烃链单键可旋转，使固定于手臂上的酶可在一 定空间摆动，降低酶与载体的相互作用并有利于与底物结合及与产物分离。本文 以自制接枝赖氨酸的交联壳聚糖微球为载体，研究了制备固定化葡萄糖氧化酶的 工艺条件及固定化葡萄糖氧化酶的酶学性质。 1实验部分 1．1实验方法 1．1．1交联壳聚糖及接枝赖氨酸交联壳聚糖微球制备 按照肖燕等脚介绍的方法制备和表征，交联壳聚糖及接枝赖氨酸交联壳聚糖微 球的主要性质基本与其相同。 1．1．2接枝赖氨酸交联壳聚糖微球固定化葡萄糖氧化酶制备 在分散有接枝赖氨酸交联壳聚糖微球的缓冲溶液中先加入适量O．1％的戊二 醛，室温搅拌吸附平衡后真空抽滤并用纯净水洗涤至中性，收集含半交联戊二醛 的微球，用适量GOD缓冲溶液分散，继续反应。过滤，收集固定化酶，用缓冲溶液 洗涤至滤液无双缩脲反应时，置于4℃贮存备用。 1．1．3葡萄糖酸分析 采用分光光度法，取定量样品，再取定量样品，依次加入15mLO．1mol／LCuSO(、 13InL 1．25mol／L 标准曲线计算出样品中的葡萄糖酸质量浓度或质量。 1．1．4葡萄糖氧化酶活力 采用4一氨基安替吡啉法，将定量浓度为O．5mol／L的葡萄糖溶液置于25℃振 荡恒温水浴中预热，再分别加入定量GoD或固定化GOD(IGOD)缓冲溶液，振荡反应 15min后吸取2．5mL反应液，与1nlL4一氨基安替毗啉溶液、lmL苯酚溶液、0．5mL 辣根过氧化物酶溶液混合均匀，剧烈振荡lmin，于500hm测定其吸光度。以吸光 葡萄糖酸和H籼所需的酶量为1活力单位(U)。 1．1．5固定化酶偶联率 采用考马斯亮蓝G-250法测定固定化前后溶液中的蛋白质质量，按下式计算 偶联率。 170 偶联前溶液蛋质质量一偶联后溶液蛋质质量 ～ 偶联前溶液蛋质质量 1．1．6固定化酶活力回收 固定化酶活力回收c％，=—d罴耋笔鬟惹星勰-。。％ 2结果与讨论 2．1接枝赖氨酸交联壳聚糖微球固定化葡萄糖氧化酶的最佳条件 以接枝赖氨酸柔性手臂交联壳聚糖微球为载体，戊二醛为交联剂，使其与游 离GOD及树脂的游离氨基形成席夫键从而实现固定化，获得固定化GOD，优化的固 交联时间3h，获得的固定化GOD活力为7．86U／mg载体，酶蛋白的偶联率及其活 力回收分别为50％及82．50％。 2．2接枝赖氨酸交联壳聚糖微球固定化葡萄糖氧化酶的主要酶学性质 实验结果指出，与游离GOD最适pH值6．O相比，固定化GOD的最适pH范围 78．68％。 活力衰减曲线为 至游离酶的 60℃下固定化GOD 比游离酶提高6．5倍：固定化GOD重复使用的活力衰减曲线(25℃)为 此计算出固定化GOD的贮存半衰期为271天。 参考文献 Tich．Journalof Ku’cerov，Marie 【l】JanaFr’ydlov，Zdenka ChromatographyB川． 2008，863；135．