拮抗细菌粗提蛋白对CMV的作用研究.pdfVIP

拮抗细菌粗提蛋白对CMV的作用研究 王凤龙 王芳 申莉莉 钱玉梅 陈德鑫 中国农业科学院烟草研究所 中国烟草总公司青州烟草研究所 山东青岛266101 摘要：通过对拮抗细菌发酵产物抑制CMV活性的测定、体外混合对CMV粒体形态的影响以及 活性物质处理烟株后系统诱导抗性的研究表明：1)拮抗细菌B6发酵产生的活性蛋白对CMV 的体外钝化作用达86.97%；2)电镜下观察到活性蛋白能打破CMV粒体的正常形态,与CMV粒 子不可逆的结合,从而降低侵染力；3）拮抗细菌粗提蛋白诱导烟草及枯斑寄主苋色藜对烟草 黄瓜花叶病毒(CMV)有一定的抗性，结果表明，拮抗细菌粗体蛋白处理后烟草叶片内CMV含 量明显降低，并随天数的增加呈由多到少再增多的趋势。 关键词：拮抗蛋白;CMV；钝化作用；病毒粒子;诱导抗性 中图分类号： 文献标识码： 文章编号： CMV是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae），黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成 员。它是一种正单链RNA病毒，ssRNA占18%，蛋白质占82%。侵染85科，365属 1000多种 [1] [2] 单、双子叶植物 ，CMV引起的植物病毒病是一种在世界范围内传播的病害 。由CMV引起 的烟草黄瓜花叶病毒病发生遍及各烟区，危害严重，使烟田减产，造成大量经济损失。本试 验从烟田耕作层土样中分离到对CMV有拮抗作用的细菌菌株B6，其分泌的抗病毒蛋白经室 内生侧和作用方式的初步分析，认为能有效地钝化CMV粒子，与病毒粒子进行不可逆的结合， 抑制病毒复制，对病毒侵染具有预防作用。本试验提取菌株B6发酵产生的活性蛋白与提纯 的CMV病毒液混合，进行透析电镜观察，在系统寄主和枯斑寄主上研究拮抗细菌活性蛋白诱 导烟草对烟草黄瓜花叶病毒(CMV)的抗性,以期为拮抗细菌活性物质诱导植物抗病毒的应用 提供理论依据。 1材料与方法 1.1试验材料 供试菌株：2007年 11月由青岛即墨市烟田土样中筛选到对CMV有拮抗作用的菌株B6。 供试枯斑寄主苋色藜（Chenopodium amaranticolor），中国农业科学院烟草研究所病 毒实验室保存的纯化CMV活体毒源三生-NN烟（ ）。 1.2试验方法 1.2.1黄瓜花叶病毒粗提液制备（二次聚乙二醇沉淀法）[3] 67g病组织叶加 134ml抽提缓冲液（0.5M柠檬酸缓冲液Ph=6.5含0.1%巯基乙醇），在 组织捣碎机中捣碎，尼龙纱过滤，过滤液加25%氯仿，振荡 15分钟，置4℃冰箱内1小时， 然后5000转/分离心20分钟，取上清液加入8%聚乙二醇（PEG6000），3%氯化钠，搅拌至 PEG完全溶化后，置4℃冰箱内4小时后，8000转/分离心30分钟，取沉淀，用悬浮缓冲液 （重蒸水）悬浮过夜，然后8000转/分离心 10分钟，取上清液，其沉淀用悬浮缓冲液再洗 一遍，两次上清液合并，其总体积为原体积的 1/10.此上清液再加入8%PEG，3%氯化钠沉淀 一次，其沉淀再用少量悬浮缓冲液过夜，然后8000转/分离心 10分钟，其上清液即为二次 PEG沉淀的粗提病毒制剂。 1.2.2拮抗细菌活性蛋白制备（硫酸铵沉淀法） 拮抗细菌B6经NB培养基发酵培养3d，离心，细菌过滤器（0.25μm）除菌体，得无菌 发酵液。取 100ml发酵液在冰水浴中加入60.3g硫酸铵，缓慢搅拌，4℃静止过夜，10000 转/分，4℃离心 15分钟，沉淀用0.02MTris-Hcl缓冲液溶解，溶解后的液体和上清用 0.02MTris-Hcl缓冲液透析48h得蛋白提液和去蛋白上清液。分别与 CMV汁液混合 15分钟 [4,5] 后，半叶法接种苋色藜 ,检测活性。将蛋白提液和蛋白上清液分别在 220nm-340nm进行紫 外吸收扫描。 [6,7,8] 1.2.3电镜样品制备（负染法） 及病毒粒体形态观察 取 1mlCMV病毒提纯液与等量的蛋白粗提液混合，以与等量无菌水混合为对照，在室温 下（25℃）放置20min后，用带膜样品载网膜面向下吸附 1-3min，取出用滤纸