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elisa原理与技术 　酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。 ?　　一、酶免疫技术的分类 　　酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。它的特点是具有高度的特异性和敏感性。如将抗原或抗体用可以微量检测的标记物(例如放射性核素、荧光素、酶等)进行标记，则在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。这种标记免疫技术一般分为两类，一类用于组织切片或其他标本中抗原或抗体的定位;另一类用于液体标本中抗原或抗体的测定。前者属于免疫组化技术(immunohistochemical telchnique)范畴，后者则称为免疫测定(immunoassay)。 　　酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为均相(homogenous)和异相(heterogenous)两种类型，实际上所有的标记免疫测定均可分成这两类。以标记抗体检测标本中的抗原为例，按照简单的形式是在试剂抗体过量的情况下进行，其反应式如下： 　　Ab*+ Ag——Ab*Ag+Ab* 　　Ab*Ag代表结合的标记物， Ab*为游离的标记物。如在抗原反应后，先把Ab*Ag与Ab* 分离;然后测定Ab*Ag或Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的抗原量，这种方法称为异相法。如在抗原抗体反应后Ab*Ag中的标记物* 失去其特性，例如酶失去其活力，荧光物质不显荧光，则不需要进行Ab*Ag 与Ab*的分离，可以直接测定游离的Ab* 量，从而推算出标本中的Ag含量，这种方法称为均相法。 　　在异相法中，抗原和抗体如在液体中反应，分离游离和结合的标记物的方法有许多种。与放射免疫测定相类似的液相异相酶免疫技测定，在某些激素等定量测定中也有应用。但常用的酶免疫测定法为固相酶免疫测定。其特点是将抗原或抗体制成固相制剂，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤。这种被称为EL1SA 的检测技术成为目前临床检验中应 　　用较广的免疫测定方法。 　　二、方法类型和操作步骤 　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体， 酶作用的底物，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的条件，可设计出各种不 　　同类型的检测方法。 　　(一)双抗体夹心法： 　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 　　(1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 　　(2)加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与同相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 　　(3)加酶标抗体：使同相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 　　(4)加底物：酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 　　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可双抗原夹心法测定标本中的抗体。 　　(二)双位点一步法： 　　在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作， 　　缩短了反应时间，如果使用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 　　在一步法测定中，应注意钩状效应(hook effect)，类同于沉淀反应中抗原过剩的后滞现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 　　(三)间接法测抗体 ： 　　间接法是检测抗体时最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗-抗体检测已与固相结合的受检抗体。故称为间接法。操作步骤如下： 　　(1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 　　(2)加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 　　(3