人 RACK1蛋白在HEK-293T和BL21细胞中的表达及COS7细胞的定位.pdfVIP

安徽 医科大学学报 ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2014Sep；49(9) ·1189 · ◇基础医学研究 ◇ 人RACK1蛋白在 HEK一293T和BL21细胞中的表达及 COS7细胞的定位 乔 正，赵 健，潘林鑫，李春雨，徐雪琴，刘晓颖 ，范礼斌 摘要 目的 构建可 以表达有活性 的蛋 白激酶 C受体 研究 表明，RACK1可结合多种胞质蛋 白或亚细胞 (RACK1)的重组质粒，检测其在细胞 内的表达与定位情况。 结构，参与多条代谢通路，发挥不同的生理作用。该 方法 设计上下游引物，以RACK1全长 cDNA序列为模板 ， 研究 构 建 了真 核表 达 载 体 pcDNA3．1一FLAG— PCR扩增 出 RACK1序列 ，分别构建到载体 pcDNA3．1和 RACK1，将其转染至 HEK一293T、COS7细胞中，并且 pGEX-5X-3。转染pcDNA3．1．FLAG—RACK1到人胚胎肾细胞 构建了pGEX．5X．3一RACK1，转化到BI21感受态细 (HEK-293T)和非洲绿猴肾成纤维细胞 (COS7细胞)，转化 胞中，观察RACK1在细胞中的表达及其分希隋况。 pGEX一5X一3-RACK1到大肠杆菌 BL21感受态细胞中表达 ， Westernblot法和考马斯亮蓝染色法检测 RACK1表达情况 ， 1 材料与方法 免疫荧光法研究其细胞 内定位。结果 成功构建 了pcD— NA3．1一FLAG—RACK1和GEX一5X．3一RACK1重组质粒。West— 1．1 质粒、菌株和细胞 含人 RACK1全长 cDNA emblot证明了其在HEK-293T细胞中的表达，考马斯亮蓝染 序列的模板 由韩家淮院士实验室提供，载体 pcD— 色显示其在 B[21菌株也能大量表达，免疫荧光显示RACK1 NA3．1、pGEX一5X一3，BL21、TG1菌 株，HEK-293T、 在COS7的细胞核与细胞质中均有分布。结论 人 RACK1 COS7细胞株 由本实验室保存。 在HEK-293T细胞和BI21菌株中均能有效表达，在COS7细 1．2 主要试剂与仪器 PrimeSTAR酶 (13本 TaKa- 胞的胞质、胞核均有分布，为进一步研究人 RACK1基因的功 Ra公司)；Hindm、EcoRV、NotI、SmaI限制性 内 能奠定了基础。 切酶、T4DNA连接酶；Trans2kDNAMarker(北京全 关键词 RACK1；基因表达 ；细胞定位；BL21 式金公司)；蛋 白Marker(美 国Thermo公司)；胶 回 中图分类号 R341；R394．2 收试剂盒与质粒小抽试剂盒 (美国Axygen公司)； 文献标志码 A 文章编号 1000—1492(2014)09—1189—04 DMEM培养基与胎牛血清 (美国Hyclone公司)；脂 质体 2000、Opti．MEM(美 国Invitrogen公司)；细胞裂 有活性的蛋 白激酶c受体(repectorforactivated 解液 (上海碧云天公司)；FLAG抗体 (美国Sigma公 Ckinase，RACK1)是一种分子量为36ku的G蛋 白 司)；IPTG、PMSF、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小 B亚单位的同源物，是WD-40蛋 白家族中的一个成 鼠IgG和