SOD活性测定(连苯三酚自氧化法).docVIP

SOD(超氧化物歧化酶)活性测定 连苯三酚自氧化法 (邓碧玉，袁勤生，李文杰．改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法[J]．生物化学与生物物理进展．1991，18(2)：163) 一、原理 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应： 反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 植物器官(花瓣、叶片等) (二)仪器设备 冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL、20μL、 100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子 (三)试剂 (1) A：Tris(三羟甲基氨基甲烷)0.2mol/L (121.14)：取24.228g定溶至1000mL (2) B：HCl (分析纯36-38％) 12当量：即12mol/L 取8.3mol/L定溶至1000mL (3) 250mLA+200mLB定溶至1000ml PH=8.3 三、试验步骤 (一)酶液的制备 (1)称取植物材料0.2g，加50mmo·L-1的Tris-HCl缓冲液(pH=8.3)1mL(分三次加) (2)2~4℃下研磨，12000r/m离心15min，制备粗酶液(每个样品设三个重复) (3)在25℃保温20min的8mL50mmol/L(PH=8.3)Tris-Hcl缓冲液中加入25℃预热的10μL 50mmol/L的连苯三酚(对照管用10mmol/LHcl代替)先加酶液再加连苯三酚 (二)酶活力的测定 酶活性单位的定义：在1mL反应液中每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50﹪的酶量定义为一个活性单位。取两个石英比色杯(带盖)，按下表加入反应物 试剂 对照管 样品管 Tris-Hcl缓冲(pH=8.3) 8mL 8mL 粗酶液 － 15μL 连苯三酚溶液 － 10μL HCl 10μL － 总量 8mL 8mL 从加入连苯三酚开始计时，迅速摇匀，使酶与底物充分反应,倒入比色杯，在752型分光光度计上每隔30s读取反应液的325nm处OD值，连续读6min。 四、利用下列公式计算酶活力 酶活力(u/mL)= {[(0.070-A325nm/min)/0.070]×100%｝/50%×反应液总体积×(样液稀释倍数/样液体积) ={[(0.070-A325nm/min)/0.070]×100%}/50%×8mL×(8mL/15μL) ={[(0.070-A325nm/min)/0.070]×100%}/50%×284.4444 = [(0.070-A325nm/min)/0.070] ×568.8888 = (1- A325nm/min/0.070) ×568.8888