RACE实战经验（节省新手时间）一、我刚做过539;、339;RACE，我个人的.docxVIP

RACE实战经验（节省新手时间）一、我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；Tm最好大于70度的原因如下：Tm大于70度，好做touchdown PCR；相应加长引物，可以更有效地扩增，尤其是针对丰度低、比较难扩的产物。插曲：为什么要做Touchdown PCR?touchdown PCR 是退火温度一步一步降低,指第一阶段PCR时退火温度在每一个循环都降低一定的值如此扩几个循环,然后进入正常PCR。这样开始的是特异性高的目的片断，到后来目的片断增加后，降低退火温度来提高产量。非特异带再开始高温扩增少，后面温度降低时，特异带产量已高于非特异产物，最后特异产物再最终产物中占优势。3、用巢氏PCR相对容易出结果；4、如果出现多个条带，要分别验证；5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。二、花了2，3个月，我的5‘RACE试验总算成功了，有些心得体会与大家分享。我用的是GeneRacer Kit，约5000人民币/kit，可做5次。本人用过GenRacer, Oligo-capping等全长cDNA合成方法。除了作过不同的方法之比较外，也有诸多实战经验。希望同仁们能对下面两篇敝作予以指正。特别提醒，在用GenRacer时，还碰到过一bug,多次对产物测序结果竟然显示引物内的序列与说明书中不一致，在上海博亚公司重新合成引物后，作对比实验，发现试剂盒中引物bug的真实存在。各位可要小心。最初我严格按照说明上的要求，总RNA取其要求的最大量即5ug（非常少，沉淀后几乎看不到），再进行RNA脱磷酸反应，反应后用苯酚：录仿等沉淀rna；再进行mRNA脱帽反应，反应后用苯酚：录仿等沉淀rna；再用T4 RNA ligase连接脱帽mRNA至GeneRacer RNA OLIGO上，反应后再次用苯酚：录仿等沉淀rna；最后用superscript III 进行RT反应，最后用GeneRacer 5’primier及我的下游GSP用高保真酶进行PCR。但由于说明上要求的总RNA实在太少，每次酶促反应后均要重新抽提沉淀rna（已去除酶等），几次一来后就看不到RNA沉淀了，RT-PCR结果为阴性。后来我考虑到酶的特点之一就是其有高效性，于是就不顾说明书上的要求，取总RNA的量远大与其要求（至少10ug），结果就出来了！！！经验：1。总RNA质量要高，先电泳看28s18s，28s亮度应该是18s的2倍。2。总RNA的量可远大与其要求的上限5ug，但要相应延长酶反应时间。3。pcr条件要自己摸，gsp的量可参考其要求的量，但其要求的dNTP量似乎偏大，自己要摸一下的dNTP量。4。一定要用高保真酶taq酶。附上我的race pcr电泳图。关于RACE的几个问题：问1：我用的是invitrogen的盒子，最近半个多月都在做5‘。我的5‘GSP两个引物一个几乎在5’边上，另一个距离5‘140BP。非常奇怪的是开始做的很顺，很容易就扩出一个500BP的带，结果测序后只有引物部分和以前的序列一样，而且扩出来的部分BLAST后功能好象和3’不相关。请问GSP引物到底多长才能鉴定所扩的基因是自己想要的啊？还有就是我5’RACE 一轮就跑出三条带，虽然暗但不像是SMEAR，为什么回收后在用内部引物扩就没带呢？难道都是非特意的条带？答：一般认为GSP在18-24bp，GC%在40-60%都是可行的，即使这样还是存在非特异性扩增，形成smear,可能有以下原因：1.引物设计有错配，在设计时最好能blast，看在基因里是否可能有错配，错配的自由能绝对值不超过9.02模板浓度过高，可以适当稀释，如10倍、100倍。3退火温度偏低了，一般模板丰度不是太低的话，采用高至Tm值的温度也能扩出条带，而且特异性较好。如果扩出的带较多，说明肯定有错配，回收后不是目的序列很正常。最好能优化反应条件，先把上一轮PCR产物稀释用内部引物直接扩再验证一下，如果有以前的带，则可以回收。一般目的条带都比较亮，比较清晰，所以如果太多杂带则不要一一回收，先改换条件扩几次，直到有比较清晰的条带。还有有时的确存在回收后无法再用原来引物扩出片段的情况。我个人认为可能回收会有影响，一般回收试剂盒用的漂洗液中有酒精，因此在最后水洗脱前最好先把回收柱风干使酒精挥发，这样回收效果好些。问2：我用的Clontech的RACE方法来对我的已知序列部分进行5‘－RACE，操作基本上按照protocol上进行，GSP1的Tm值是70度，但