生物技术大实验试题.docVIP

2013级生命科学学院硕士研究生 《生物技术大实验》期末考试 在用流式细胞仪检测细胞凋亡的双色试验中，分别用何种染料区分早期凋亡和晚期凋亡，各自的原理是什么？在流式数据显示中各处于哪个位置，用十字象限图标注。（20分） 通过AnnexinV-FITC/PI 法分析细胞凋亡 细胞膜的重排发生在凋亡的早期，这种重排导致磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。这一事件可通过Annexin V 的染色来检测。Annexin V 是一种Ca 2+ 依赖的磷脂结合蛋白，可与凋亡细胞膜上外翻的PS相结合，采用荧光（如FITC）标记的Annexin-V 来与凋亡细胞结合。碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin- V与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。正常细胞膜联蛋白V（-）PI（-），早期凋亡细胞膜联蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞膜联蛋白V（+）PI（+）。 AnnexinV-FITC 二、如果有人让你在大肠杆菌细胞中表达哺乳动物细胞的谷胱甘肽过氧化物酶，怎样做才能获得成功，为什么？请设计出实验方案。（20分） （提示：谷胱甘肽过氧化物酶中含有由UGA编码的含硒半胱氨酸残基） 哺乳动物细胞的谷胱甘肽过氧化物酶含有含硒半胱氨酸残基，它由特殊位置的终止密码子UGA编码。如果直接将它的基因通过载体导入到大肠杆菌细胞，尽管它可以转录，但翻译的时候遇到含硒半胱氨酸的密码子的时候会提前结束，因此得不到全长的有功能的谷胱甘肽过氧化物酶。硒代半胱氨酸（Sec）在终止子UGA上的读出需要一个附加的信号元件——硒代半胱氨酸插入元件（SECIS）。利用Eshcerihcai.oil表达硒蛋白，最难点在于需要在目的蛋白编码Sec的UGA下游ORF内引入SECIS，这必然会影响目的蛋白的空间构象，从而影响蛋白酶的活力。对于SECIS的引入，可直接将SECIS插入目的蛋白，也可对目的蛋白的氨基酸残基进行替换突变，或直接插入与替换突变结合使用。为了尽量减小SECIS元件对目的蛋白空间构象的影响，需应用蛋白质工程的手段，如突变与能量优化、自由能评估等，对蛋白质分子进行再设计。UGA与最小SECIS 间的距离显著影响通读性，当 UGA左移一个密码子时，通读性下降24%；当 UGA 左移两个密码子时，通读性下降80%；当UGA左移三个密码子时，通读性下降60%。 根据这些原理设计实验： 目的基因在表达载体中的构建 1质粒的提取 2目的基因的获得 3琼脂糖凝胶电泳 4 DNA 片段的回收 5 限制性酶切酶消化DNA 6 酶切产物的连接 7 大肠杆菌感受态细胞的制备 8 连接产物的转化 9 阳性克隆的筛选及其鉴定 10 重组质粒及其菌种的保存 含有硒代半胱氨酸的谷胱甘肽过氧化物酶基因的表达 1 pE 系列质粒与 pSU 质粒的共转化 2 工程菌的诱导表达 3 工程菌表达产物的分离纯化 4 表达产物的鉴定 三、在菌种鉴定方法的应用中，16sRNA法和脂肪酸图谱法各有哪些优势和劣势？请举例说明。（20分） （一）16sRNA法20多年前，以16S rRNA为主要基础的PCR技术、电泳技术、克隆文库技术、荧光原位杂交和流式细胞术等免培养的分子生物学技术开始应用到菌群的研究，真实反映了环境样品中菌群的结构和丰度，避免了传统方法在菌群检测中低丰度易培养细菌被高估的局限性，促进了菌群高度多样性的研究。 1　PCR及其相关技术 ① T2RFLP 末端限制性片段多态性法是由RFLP发展而来的方法，又称为16S rRNA基因的末端限制性片段，是将PCR引物中的一条加以荧光标记，对扩增产物用限制性内切酶进行切割并电泳，根据片断的大小不同以及标记片断种类和数量的不同来分析群落的结构及组成。 16S rRNA序列比较 通过建立细菌16S rRNA文库的方法可以进行菌群分类的深入分析。rRNA 序列比较是通过比较分析缓慢进化的rRNA分子成分，从而在微生物系统发育上进行分类。其主要步骤包括： ①样品中总DNA 的提取；②建立基于λ噬菌体的DNA克隆文库；③以种类特异性的16S rRNA探针筛选文库；④测序；⑤序列的比较分析。 2　荧光原位杂交技术(FISH)及其相关技术 荧光原位杂交技术是由Gall和Pardue最早描述，其间经历了放射性标记探针阶段和荧光标记探针阶段。与放射性探针相比，荧光探针具有以下优点：安全、简便、灵敏、快速，可同时检测几种微生物。核酸荧光原位杂交是指通过荧光标记的寡核苷酸探针特异地和互补核酸序列在完整的细胞内结合，用显微镜和流式细胞术等荧光检测技术进行观察和分析。核酸探针是通过比较16S rRNA序列和数据库中的序列进行设计，