MTT的测定方法基本上是利用细胞本身的酵素对受质的作用.docVIP

MTT的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生顏色的變化，再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞裂殖素的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可以測到較高的吸光值。利用此一原理，也可以來測定細胞的增殖反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高，對懸浮性細胞則較不理想，進行本實驗時應特別注意。细胞增殖的测定：四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)[3]：选择对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化5～8min，调整细胞浓度为5×104/mL加于96孔培养板，每孔100μL，再分别加入不同浓度药物（1.5、1.8、2.2、2.5、2.8、3.2mg/mL），并设置培养液对照。　　置37，体积分数为5％CO2条件下培养56～72h，于结束前4h加入MTT10μL/孔，4h后弃上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100μL/孔，振荡10min左右，置酶标仪测A值，波长为570nm。用含15％小牛血清的1640培养液将801-D细胞或肿瘤细胞接种于96孔板，每孔100?μl，设空白组及不同肿瘤细胞浓度组，每组分别设为5×102、1×103、5×103、1×104、2×104、5×104／孔。置37、5％CO2饱和湿度培养72小时，弃上清。每孔加MTT 20?μl(浓度5?mg／ml)，继续培养4小时。加100?μl DMSO，平板振荡器上震荡5分钟，在酶标仪上以570?nm波长检测。脾T淋巴细胞增殖反应测定[4]脾细胞（2.5×105/孔）在37，5% CO2培养条件下，用10ug/ml gD蛋白（阴性对照组为RPMI1640培养基；阳性对照组为5ug/ml PHA）刺激3天。加入10ul MTT(5mg/ml)，37继续培养4小时后，每孔加入100ul DMSO溶解formazon。检测各孔490nm光吸收值（每一组设3个重复孔）；计算刺激指数（SI）=A490nm(实验组)/A490nm(阴性对照组)。3.1.1 MTT法3.1.1.1 原理当T淋巴细胞受ConA、PHA等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解　将MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色的甲(formaZan)结晶而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。3.1.1.2 丁器和材料RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2－　基乙醇(2－ME)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐、异丙醇、MTT、Hanks液、PBS缓冲液(pH7.2-7.4)200目筛网、24孔培养板，96孔培养板(平底)，手术器械、二氧化碳培养箱、　联免疫检测丁、超净工作台3.1.1.3 实验步骤完全培养液 RPMI1640 培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清，1％谷氨　胺(200mmol/L)，青霉素(100U/mL)，链霉素(100ug/L)及5×10－5mol/L的2－　基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0－7.2，即完全培养液。ConA液 用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(－20)保存。无菌Hanks液 用前以3.5％的无菌NaHCO3调pH7.2－7.4。MTT液 将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。性异丙醇溶液 96mL 异丙醇中加入4mL 1mo1/L的HC1，临用前配制。3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心10min (1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为2×106个/mL。3.1.1.3.3淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加50ul ConA液(相当5ug/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2，37培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50u1/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3￣6孔作为平行样，用　联免疫检测丁，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入1mL比色杯中，在721分光光度计上比色测定，波长570nm。3.1.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析进行数据统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值，即可判定该项试验结果阳性。小鼠18只,