中国非小细胞肺癌患者EGFR双突变的分子流行病学及生物学特性研究.docVIP

中国非小细胞肺癌患者EGFR双突变的分子流行病学及生物学特性研究 下载全文 ????加入收藏夹????点击:36 ????下载:15 由于EGFR与NSCLC的发生与发展关系密切，针对EGFR的靶向治疗已经成为研究的热点。近年来人们开始把目光投向这一新手段，期望能够为NSCLS的治疗带来质的飞跃。当前用于NSCLC靶向治疗的药物主要有针对EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂Gefitinib和Erlotinb两种。 目前已经明确，NSCLC的EGFR突变与TKI的疗效有密切的关系。最近几年中已经发王见了超过30种的EGFR突变，其中最丰要的两种TKI敏感性突变为19外显子以LREA为中心的4-6个氨基酸序列的缺失以及21外显子的L858R点突变，总共占85-90﹪以上。东亚患者、女性、腺癌、不吸烟者的突变率明显高于其它亚组患者，对TKI的反应率也相应较高。 由于亚洲患者EGFR突变率远高于西方患者，EGFR双突变在亚洲NSCLC患者中并不少见。研究表明亚洲NSCLC患者EGFR双突变约占所有EGFR突变患者的6.9-11.8﹪，而且也发现了delE746-A750/L858R两种主要活性突变并存的双突变。由于第2突变不可避免地改变了EGFR突变体的空间结构，其生物学功能必然与原先的单突变体有所差别。随着研究的深入，越来越多的EGFR双突变将会被发现。然而，这些新的EGFR双突变的生物学特性尚未清楚，对TKI的敏感性也不明确。 目的: 1.通过对EGFR测序的方法在突变率较高的中国NSCLC患者中进行EGFR双突变的分了流行病学研究，了解EGFR双突变的分布规律并进一步通过体外实验明确其生物学特性以指导临床个体化TKI治疗的用药选择。方法1.非选择性中国人NSCLC患者肺癌组织标本的EGFR测序2004年1月至2005年7月期间广东省人民医院肿瘤中心收治的非小细胞肺癌患者，采用Trizol法及石蜡包埋组织DNA提取法获得所有标本的基因DNA进行PCR测序。除对EGFR的18，19，21外显子测序外，接受过Gefitinib治疗的病例还进行KRAS第2显子及EGFR第20外显子的耐药性突变榆测。 2.EGFR双突变的等位基因定位实验提取携带EGFR双突变的肺癌组织的总RNA进行EGFR18-21外显子全长的RT-PCR，并使用pMD18-T载体进行TA克隆测序，分析EGFR双突变的等位基因分布情况。 3.EGFR双突变表达载体的构建利用Stratagene公司开发的QuickChange XL定点突变试剂盒将L858R定点突变到已插入了EGFR delE746-A750的pcDNA3.1(-)表达载体上，从而构建EGFR delE746-A750/L858R．双突变表达载体。通过双酶切及EGFR开放读码框全长测序进行鉴定。 4．TKIs药敏实验将构建成功的EGFR双突变以及delE746-A750，L858R两种单突变载体与野生型载体通过脂质转染的方法分别瞬时转染至293T细胞中。转染40小时后以分别以(Gefitinib与Erlotillib浓度梯度处理3小时。处理完成后以EGF刺激诱导EGFR磷酸化。收集细胞提取总蛋白进行EGFR Tyr1068位点磷酸化的WesternBlotting检测。使用Quantity One光密度分析软件对Western Blotting的结果进行分析，获得EGFR磷酸化被TKIs抑制程度的比值，并作图比较。 5.EGFR双突变体对P13K/Akt信号传导通路效应的初步研究将上述4种EGFR表达载体瞬时转染至293T细胞中。转染48小时后收集细胞提取总RNA行P13K及Akt两种基因的实时荧光定量PCR，并比较4种转染后细胞中以EGFR转录水平校正后的这两种基因转录水平，初步了解EGFR双突变体对P13K/Akt通路的影响。 结果: 1.EGFR双突变在中围NSCLC患者中的流行病学特点在全部145例中国NSCLC患者中发现了5例EGFR双突变，均为delE746-A750/L858R，发生率约3.4﹪。5例患者均为腺癌类型，男4例，女1例，男女发生率没有明显差别，分别为3.5﹪与3.2﹪。本组病人接受Gefitinib治疗后的中位生存期为20.0个月，高于单突变患者的18.0个月以及野生型患者的9.0个月，但由于例数太少，差异没有统计学意义。 2.EGFR双突变的等位基因定位实验结果共有3例携带EGFR双突变的肺癌组织提取总了RNA并行RT-PCR，TA克隆测序结果显示每例标本随机挑选的克隆仅为野生型及双突变两种，没有检测到单突变的克隆。 3.EGFR双突变表达载体的构建使用定点突变的方法构建了EGFR双突变全长的pcDNA3.1(-)表达载体，经鉴定无误。 4.TKI药敏结果DelE746-A7