转基因植物分子检测与鉴定方法及进展.docVIP

转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展 随着分子生物学和植物基因工程的不断发展，越来越多的育种工作者开始利用转基因技术获得常规育种技术难以得到的新种质和新品种。植物转基因技术最大的好处在于可以打破自然界物种间原有的生殖隔离，促进基因在不同物种间的交流，极大地丰富变异类型，增大遗传多样性，为植物新品种的培育提供丰富的育种资源。通过对基因功能的研究，筛选m目的基因，还可实现植物性状的定向改良。因此该技术自1983年首次获得转基因植物以来，便深受育种工作者青睐，得到了蓬勃地发展。至今已有30多科约200多种植物转基因成功；国际上相继有30多个国家批准3 000多例转基因植物进入田间试验，并且在美国、加拿大、中国等20多个国家成功进行了商品化生产…。到2006年止，全球转基因作物的商业种植面积达1．02亿hm2，比2005年增长13％，是1996年的62倍。转基因作物品种在农业生产中日益显现出巨大潜力。 植物转基因操作中，除利用抗生素抗性和除草剂抗性等选择基因排除非转化细胞而留存转化细胞，以及利用Gus和CFP等报告基因显示转基因成功外，更重要的是从分子水平鉴别出阳性转化体，明确目的基因在转基因植株中的拷贝数和转录与表达情况。本文就常用的转基因植株检测与鉴定方法作一概述，并对近期发展起来的新方法做简要介绍。 1 外源基因整合与否及其整合拷贝数的鉴定 1．1 PCR(p01 ymera se chain reaction)检测 1．1．1 常规PCR PCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，通过3个温度依赖性步骤(即变性、退火和延伸)完成的反复循环。经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性。根据外源基因序列设计出一对引物，通过PCR反应便可特异性地扩增出转化植株基因组内外源基因的片段，而非转化植株不被扩增，从而筛选出可能被转化的植株。 由于PCR检测所需的DNA用量少，纯度要求也不高，不需用同位素，实验安全，操作简单，检测灵敏，效率高，成本低，使之成为当今转基因检测不可或缺的方法，被广泛应用。然而，PCR检测易出现假性结果。引物设计不合理，靶序列或扩增产物的交叉污染，外源DNA插入后的重排、变异等因素都会造成检测的误差。因此常规PCR的检测结果通常仅作为转基因植物初选的依据，有必要对PCR技术进行优化，并对PCR(real-time quantitative PCR)检测为阳性的植株做进一步验证。 1．1．2 优化的PCR PCR技术的优化目的在于提高扩增产物的特异性、推测目的基因的拷贝数及整合情况，从而提高检测的效率。常见的有多重PCR(Multiplex PCR， MPCR)、降落PCR(Touchdown PCR，TD-PCR)、 rpPCR、反向PCR(inverse PCR，IPCR)、实时定量 PCR等。 1．1．2．1 多重PCR MPCR是在同一管PCR反应体系中，使用多套针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行PCR扩增的方法。与普通PCR法相比，MPCR反应更快捷，更经济，只需1次PCR反应，就能检测多个靶基因。 Matsuoka等用该方法同时扩增出了转基因玉米的5种外源基因Btll，Btl76Mort810，T25and GA21。陈明洁等用MPCR对转基因小麦植株的报告基因uidA和选择基因hat进行扩增，MPCR的检测结果与单基因的PCR检测结果完全一致。 由于MPCR技术是在同一反应管中加多对引物同时对多个靶位点进行检测，因此对引物的要求较高，不同引物间的相互干扰应降至最低；同时扩增的目的片段大小也不能太接近，否则凝胶电泳时难以分开，无法辨别。 1．1．2．2 降落PCR TD-PCR是一种在一个反应管或少数几个反应管中通过一系列退火温度逐渐降低的反应循环来达到最佳扩增目的基因的PCR方案。它通过体系自身的代偿功能弥补以反应体系和并非完美的循环参数所造成的不足。此策略保证了最初形成的引物模板杂交体具最强的特异性。尽管最后一些循环采用的退火温度会降到非特异的Tm值，但此时的扩增产物已开始几何扩增，在余下的循环中处于超过任何非特异性PCR产物的地位，从而使PCR产物仍然呈现出特异性扩增。 R．H．Don等认为，PCR过程中的前几个循环对于扩增产物的纯度非常重要，因此前几个循环较高的退火温度，会增加引物与模板结合的特异性，TD-PCR方法可以阻止非特异性产物的形成。由于TD-PCR的策略是在较早的循环中避免低Tm值配对，故在TD—PCR中必须采用热启动技术。田路明等用TD-PCR对高羊茅转基因植株两个片段进行了扩增，结果表明TD— P