体积排阻色谱法测定低分子量肝素抗凝血因子Xa.pdfVIP

２０１３年７月 Ｖｏｌ.３１Ｎｏ.７ Ｊｕｌｙ ２０１３ ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ６８４ ~６９０ 庆祝欧庆瑜先生八十华诞专栏 研究论文 ＤＯＩ:１０.３７２４/ ＳＰ.Ｊ.１１２３.２０１３.０４０２９ 体积排阻色谱法测定低分子量肝素抗凝血因子Ｘａ 的活性 张倩倩ꎬ　 康经武∗ (中国科学院上海有机化学研究所ꎬ上海２０００３２) 摘要:发展了一种基于体积排阻色谱测定低分子量肝素(ＬＭＷＨ)抗凝血活性的方法ꎮ 利用肝素与抗凝血酶Ⅲ(ＡＴ Ⅲ)结合后可增强ＡＴⅢ对凝血因子Ｘａ(ＦＸａ)抑制作用的原理ꎬ通过测定加入ＬＭＷＨ后ＦＸａ水解其生色底物产生 对硝基苯胺(ｐＮＡ)这一反应的抑制程度确定ＬＭＷＨ 的活性ꎮ 首先将含有一定浓度ＬＭＷＨ 的缓冲溶液与ＡＴⅢ溶 液混合ꎬ然后依次加入ＦＸａ和生色底物ꎬ分别孵育一段时间ꎮ 底物被ＦＸａ水解ꎬ产生游离的ｐＮＡꎮ 体积排阻色谱 可将小分子产物ｐＮＡ与其他大分子分离开ꎬ因而可以在ｐＮＡ 的最大吸收波长下得到高灵敏度的测定ꎬ并且不再受 其他成分的干扰ꎮ 该方法重复性好ꎬ灵敏度高ꎬ极大地减少了样品的消耗量ꎬ降低了成本ꎬ并且还可进行各种复杂 样品(如血浆)中ＬＭＷＨ抗ＦＸａ活性的监测ꎮ 关键词:体积排阻色谱ꎻ抗凝血因子Ｘａꎻ低分子量肝素 中图分类号:Ｏ６５８　 　 　 文献标识码:Ａ　 　 　 文章编号:１０００￣８７１３(２０１３)０７￣０６８４￣０７ Ａｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ａｎｔｉ￣ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｈｅｐａｒｉｎｓ ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ＺＨＡＮＧ ＱｉａｎｑｉａｎꎬＫＡＮＧＪｉｎｇｗｕ∗ (ＳｈａｎｇｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ ＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ ＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０００３２ꎬＣｈｉｎａ) Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｔｈｅ “ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ” ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｈｅｐａｒｉｎｓ (ＬＭＷＨｓ) ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ￣ｂａｓｅｄ ａｎｔｉ￣ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ａｓｓａｙ. Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ￣ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ａｓｓａｙ ｉｓ ｔｈａｔ ＬＭＷＨ ｉｓ ａｄｄｅｄｔｏ ａ ｋｎｏｗｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｅｘｃｅｓｓ ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ａｎｄ ｅｘｃｅｓｓ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ. Ｉｔ ｗｉｌｌ ｂｉｎｄｔｏ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎｄｆｏｒｍ ａ ｔｒｉｐｌｅｔ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｘａꎬｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ Ｘａ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ｃａｎ ｓｔｉｌｌ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅꎬ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ ｆｏｒ ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｉｓ ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｔｏ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ/ ＬＭＷＨ. Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ ａｒｅｇｉｖｅｎ ｉｎ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｕｎｉｔｓ/ ｍＬ ｏｆ ａｎｔｉ￣ｆａｃｔｏｒ Ｘａꎬｓｕｃｈ ｔｈ