MasterTaq聚合酶应用于腐殖质污染的DNA模板的PCR扩增….pdfVIP

文献参考 No. 3 MasterTaq 聚合酶应用于腐殖质污染的 DNA 模板的 PCR 扩增反应 引言 Taq 酶为我们实验室中常用的、认为最合适的 Taq 酶。从 E. coli 中抽提的 DNA 模板作为阳性对照。 在土壤或河床沉积物中采样用于提取总 DNA 时，总会 伴随提取到土壤中的其他物质，主要有腐殖质或其他的腐 在热启动 PCR 反应 中使用高浓度的 BSA，结果表明可 败物质，这些物质将会干扰 DNA 的检测和生化反应（8 ）。 以降低 Taq 酶对土壤提取物反应的敏感性，并提高 PCR反 这些污染物会抑制 PCR 反应中 Taq 聚合酶的活性（7，9， 应的可重复性。 10，11）或是抑制限制性内切酶的活性（5，9 ）。腐败物 的量达到最少 1ng 时，即能够抑制 PCR 反应（1 ）。腐质酸 和核酸具有相似的理化特性，因此很难完全去除。很多研 究都在致力于提供一种有效的纯化方法，但目前还没有公 认的最好方法（2，6，12 ）。 从海底取样 本文的实验和结果，说明了 MasterTaq 聚合酶在扩增 从沉船打捞物中提取的含腐殖质污染的 16S rDNA 基因的 PCR 反应中具有很好的适应性（Svalbard，Arctic Ocean ）。 材料与方法 DNA 抽提：根据 Zhou 等（12）的方法直接提取沉积 物中的总 DNA。实验步骤包括 3 次反复冻融，在含 SDS和 CTAB 的高盐浓度的缓冲液中对悬液进行热处理和化学裂 得到沉积物 解，并进行蛋白酶 K 消化。将初始抽提的 DNA 经透析纯化， 但是 DNA 仍呈褐色，说明有腐殖质污染。 PCR 扩增：采用 EUB008(3) 和 EUB1492(4) 通用引物 从抽提和经纯化的总 DNA 中扩增 16S rDNA 基因。在 Eppendorf Mastercycler® 梯度 PCR 仪中进行如下反应：引 物各 50pmol，2.5 μmol dNTP，300 μ g牛血清白蛋白 从沉积物中提取 DNA （BSA），1x 反应缓冲液，1x TaqMaster PCR 增强剂，1U MasterTaq DNA 聚合酶，加无菌水至反应终体积 100μl。 纯化初始抽提的 DNA 为了避免引物非特异性退火而发生非特异性扩增，在反应 混合物加热至 70℃时，加入 80-500ng 模板 DNA。循环程 序为： 70℃ 1 分钟，1 个循环 ；95℃ 1 分钟， 40℃ 1 分钟， PCR 72℃ 3 分钟，38 个循环；最后 1 个循环，95℃ 1 分钟， 40℃ 1 分钟，72℃ 10 分钟。同时进行的对照实验中使用的 图 2 ：海水沉积物的取样、DNA 样品制备和 PCR 反应。 13 文献参考 结果与讨论