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凝胶层析法分离纯化蛋白质 【目的】 掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能 【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。 总结： 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 【实验器材】 层析柱 恒流泵 紫外检测仪 部分收集器 试管等普通玻璃器皿 【实验试剂】 待分离样品 葡聚糖凝胶 Sephadex G-100 洗脱液：0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液 【操作方法】 一、凝胶的处理 　　　Sephadex G-100干粉经蒸馏水室温充分溶胀48h，或沸水浴中煮沸2h，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。 二、装柱 关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高，将浓浆状的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降约1㎝高度后打开出水口，继续加入凝胶浆，直到凝胶沉积至一定高度即可。装柱要求连续，均与，无气泡，无“纹路”。 三、平衡 将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2～3倍柱床体积的洗脱液平衡，流速为0.5ml/min。 四、加样与洗脱 将柱中多余的液体放掉出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口，加洗脱液至液层4cm左右，接上恒流泵，开始洗脱（ 0.5ml/min）。 五、收集与测定 用部分收集器收集洗脱液。紫外检测仪280nm处检测，将检测信号输入色谱工作站系统，绘制洗脱曲线。 六、凝胶柱的处理 凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（2~3倍床体积）即可。 注意事项 各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。 * * 凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。 单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。 凝胶过滤层析 带网孔的葡聚糖珠 小分子进入葡聚糖珠内 大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出 凝胶过滤层析过程示意图 凝胶过滤层析过程示意图 小分子 大分子 凝胶基质 凝胶珠 *