检验医学专业实验IV 临床微生物学检验部分.docVIP

细菌形态学检查 一、不染色标本检查（压滴法) 【操作方法】 1、用接种环取大肠杆菌菌液2-3环，置于洁净载玻片中央。 2、取一张洁净盖玻片从菌液一边缓缓放下，覆盖于菌液上，避免菌液中产生气泡。 3、先用低倍镜找到观察部位，再换高倍镜观察细菌的运动。 【结果观察】 有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显的方向性位移 无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变 二、革兰染色法 【步骤】：制片、染色、镜检 1、制片 涂片 ：取洁净载玻片一张，用接种环取生理盐水2环，置于玻片上，接种环灭菌后，取细菌培养物少许与盐水混匀，并涂成均匀薄膜涂片。如用液体材料，如痰、尿液、脓汁等可直接涂片，不必加生理盐水。 干燥 ：涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将标本面向上，小心间断地在弱火高处烘干，但切勿紧靠火焰将涂膜烤枯。 固定：涂片干燥后，将标本片在酒精灯上快速的来回通过三次，共约2s～3s，注意温度不可太高，以涂片涂膜的反面触及皮肤觉轻微烫觉即可。 固定目的：①杀死细菌；②使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；③菌体蛋白变性易着色。 2、染色 结晶紫初染 1 min → 卢戈氏碘液媒染 1 min → 95％酒精脱色 30sec～1 min → 稀释石炭酸复红复染 1 min，油镜观察 【原理】： ①革兰阳性细菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁结构较疏松，肽聚糖层少，脂质含量多，乙醇易渗入。 ②革兰阳性菌的等电点低，革兰阴性菌的等电点较高，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固不易脱色。 ③革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。 【结果观察】：紫色为阳性，红色为阴性 【影响因素】 ①操作因素：涂片太薄或太厚，固定时菌体过分受热，以及脱色时间长短，都会影响染色结果 ②染液因素：所有染液应防止染液蒸发而改变浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用；涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果 【意义】： ①鉴定细菌：可将细菌分为革兰阳性菌（紫色）和革兰阴性菌（红色）， ②观察致病性：大多数G+菌以外毒素为主要致病物质，而G- 菌以内毒素为主要致病物质。两者的致病机制和临床表现各不相同， ③参考选择抗菌药物：大多数G+菌对青霉素、头孢菌素等敏感；大多数G- 菌对氨基苷类抗生素如链霉素、庆大霉素等敏感。 【用途】：一般细菌学检查或鉴定 三、细菌的形态及排列方式： ①杆菌 ②球菌（包括：葡萄球菌、双球菌、链球菌、四联球菌和八叠球菌） ③螺形菌（菌体仅有一个弯曲呈弧形的螺形菌称为弧菌；菌体有数个弯曲的螺形菌称为螺菌；菌体细长、弯曲呈弧形的螺形菌称为螺杆菌） 四、细菌特殊结构的观察 芽孢：破伤风杆菌（革兰染色法） 荚膜：肺炎双球菌（革兰染色法） 鞭毛：变形杆菌（革兰染色法观察不到，需用特殊染色法，如镀银染色） 培养基的制备 【分类】 按物理性状分为：液体培养基（多用于增菌）、固体培养基（多用于分离纯化鉴定细菌）、半固体培养基（用于观察动力、短期保存） 按营养组成和用途分为：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、特殊培养基 【步骤和方法】： 1、计算用量，2、调配成分，3、溶解，4、校正pH值，5、分装，6、灭菌：选择合适的灭菌方法。7、质量控制：需做无菌试验和效果试验。8、保存：注明名称、日期，置冰箱或冷暗处。 【配方】 肉汤培养基：蛋白胨 1g，牛肉膏 0.3g，NaCl 0.5g，蒸馏水 定容至100ml，调pH至7.4-7.6，分装，高磅灭菌20分钟。有成品培养基，直接按说明操作。（作为无糖基础培养基用，适用于营养条件一般的细菌） 尿素培养基：蛋白胨 1g，NaCl 5g，葡萄糖 1g，尿素 20g，KH2PO4 2g，2 g/L 酚红 6ml，加蒸馏水 定容至1000ml，调pH小于6.8，分装，低磅灭菌10分钟。 葡萄糖蛋白胨培养基：蛋白胨 7g，葡萄糖 5g，K2HPO4 5g，蒸馏水 定容至1000ml，调pH至7.2-7.4，分装，低磅灭菌15分钟。 苯丙氨酸培养基：酵母浸膏 3g，NaCl 5g，Na2HPO4 1g，L-苯丙氨酸 2g，琼脂 12g，蒸馏水 定容至1000ml，调pH至7.2-7.4，趁热分装成2ml/支，低磅灭菌，摆斜面。 【注意事项】 1、培养基的调配溶解：现在锥形瓶底加入少量水，再加入蛋白胨等成分，以防其粘瓶底烧结。制备大量培养基时，除玻璃容器外，还可用铝锅、搪瓷桶，但不可用铜铁容器，以免其离子进入培养基（培养基中铜含量超