在小鼠早期神经母细胞谱系中重建耳泡结构.docxVIP

在单细胞精度上重建小鼠耳泡以及早期的神经母细胞谱系SUMMARY耳泡（otocyst）含有成熟内耳中绝大部分细胞类型的祖细胞。发育谱系分析以及基因表达研究提示在早期耳泡中，不同的祖细胞群被分隔在分散的轴向区域中（axial domains）。本文中，我们对382个取自发育中耳泡及神经母细胞谱系的细胞个体做了高并行定量RT-PCR（highly parallel），评估其中的96个基因，这些基因代表着确定的耳标志物，信号-通路相关转录产物，以及新的耳特异性基因。通过对数据矩阵进行多元集簇分析，主要成分分析，以及网络分析（multivariate cluster, principal component, and network analyses），我们得以确定神经母细胞的不同分层，并在单细胞精度上描述了这个细胞群中基因表达的渐进性过程。这进一步耳泡的一个三维模型，在这个模型中，每个细胞个体都可以在空间表达域上精确地定位。我们的生物信息模型显示了在早期神经母细胞发育及感觉前体区域（prosensory domain）特化过程中不同信号通路活化的空间动态。INTRODUCTION在本研究中，我们使用耳泡，也就是脊椎动物内耳的前体来充当模型系统，以探索96个基因在空间上，时间上，以及功能水平上的单细胞转录特征。耳泡是一个三维结构，源自听板（otic placode），与发育中的菱脑相邻（Fritzsch et al.,2002; Morsli et al.,1998）。它含有会产生内耳，以及前庭与耳蜗神经元的细胞群中的绝大部分（Corwin and Cotanche, 1989; Groves and Fekete, 2012; Swanson et al.,1990）。尽管人们通过对单个基因表达方式的研究累积了丰富的知识（Alsina et al.,2009; Radde-Gallwitz et al.,2004），但尚不清楚位于耳泡中不同位置，比如说背部或腹部的特定类型的细胞群性质是否一样，或者是否可以进一步细分成更小的，由空间位置决定的细胞亚群。同样的，人们猜想源自耳泡的发育中感觉器官及神经母细胞，是不同细胞或细胞群，周围组织影响，以及细胞命运限定之间区域性协同关系的产物（Brigande et al.,2000; Fekete and Wu, 2002; Groves and Fekete, 2012; Wu and Kelley, 2012）。基于细胞群的研究手段无法识别出少见的细胞类型，也无法显示那些用活化信号通路来决定细胞身份的基因的空间关系。与之相比，单细胞分析技术是一种强有力的工具，可以研究全局性细胞异质性，以及在局部水平上描述机制（Tischler and Surani, 2013）。我们的目标是用小鼠耳泡作为一个简单却高度组织性细胞系统的范例，并用单细胞定量基因表达分析来获得对区域性细胞身份，动态过程，以及活化信号通路区域的了解。我们用微阵列做了36672份个体定量RT-PCR，分析了382个小鼠耳泡细胞和神经母细胞个体。利用相互关系，主要成分，以及网络拓扑结构的三重互补分析（three complementary analyses），我们识别出了细胞特异性转录模体中遗传下来的神经母细胞发育过程的动态结构。我们在已知的空间性基因表达类型的背景下，进一步应用生物信息学方法，通过计算建立了一个耳泡器官模型，在单细胞水平上提供了深入的生物学视野。我们的分析描述了耳部发育过程中的时间和空间成分。这使得我们可以将高维度数据整合成简单的模型，使我们对细胞异质性有更好的理解。RESULTS耳泡细胞和神经母细胞个体的转录分布情况在哺乳动物内耳发育期间，转录因子Pax2是第一种在听板中被发现的因子，并且在发育过程中持续在耳泡中表达（Hidalgo-Sanchez et al.,2000）。在Pax2Cre+/-；Gt(ROSA)26SormtdTomato,mEGFP报导小鼠中（Muzumdar et al.,2007; Ohyama and Groves, 2004），听板的后续发育产物包括所有的耳泡细胞，以及分层的，表达membrane-EGFP的神经母细胞，而周围的非耳部细胞继续表达memberane-tdTomato荧光蛋白（Fig.1A and 1A’）。利用荧光活化细胞分类技术（FACS），我们在胚胎第10.5（E10.5）时从耳泡及其紧密相邻组织中收集了384个membraneEGFP(+)/memberane-tdTomato(-)细胞（Fig.1B and Fig.S1 online）。我们用微流体定量PCR平台定量测定了96种不同转录产物的表达情况。包括已知在小鼠耳泡中表达的转录产物，在一项独立研究中发现的潜在