高效液相色谱(HPLCHigh Performance Liquid.docVIP

高效液相色谱（HPLC：High Performance Liquid Chromatography 加样 流动相 固定相 流动相 A A B C B C B A 固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。 通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类： 分配色谱：—— 分配系数 亲和色谱：—— 亲和力 吸附色谱：—— 吸附力 离子交换色谱：—— 离子交换能力 凝胶色谱（体积排阻色谱）：—— 分子大小而引起的体积排阻 分配色谱又可分为： 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。 固定相（柱填料）： 固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。 最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。 使用微粒硅胶要特别注意它的使用pH范围是 2～7.5，若过碱（＞pH7.5），硅胶会粉碎或溶解；若过酸（＜pH2），键合相的化学键会断裂。 键合相使用硅胶作基质的优点是：硅胶的强度大；微粒硅胶的了孔结构和表面积易人为控制。化学稳定性好。 μm）。 按键合到基质上的官能团可分为： ⑴反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。 ⑵正相柱：填料是极性的，官能团为 －保留值 进样 t0 tR ⑴保留时间“tR”：进样至出峰的时间。 ⑵死时间“t0”：不被柱子吸附的惰性物质的出峰时间。死时间“t0”的测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳，反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO2、NaNO3等。 ⑶容量因子“k’”： 或： “k’”是比“tR”还常用的保留值，它与柱子的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之体企积比）有关。“k’”又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消除了保留值的波动因素，而平衡常数“K”是平衡时物质在两相中的浓度比。 k’值的范围： 0.4＜k’＜20～30 k’＝2～5为佳，过大则耗时太长。 保留体积：VR＝tR?FC ( FC --- 流动相的流速 mL/min ) VR是在tR时间内流动相流过柱子的体积。 调整保留时间：tR’＝ tR－t0 调整保留体积：VR’＝ VR－VR0＝tR’ ?FC 选择性指标“α’”和相对保留值“α” α’可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏： 进样 tR(1) tR(2)