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第二节 基因工程研究 一、基因工程的基本原理 (1)利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复 制的特性，将外源基因与载体分子重组，通过载体分 子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提 高其宏观表达水平。 (2)筛选、修饰和重组启动子、增强子、操作子、终止子 等基因的转录调控元件，并将这些元件与外源基因精 细拼接，通过强化外源基因的转录提高其表达水平。 (3)选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻 译调控元件，强化受体细胞中蛋白的生物合成过程。 (4)基因工程菌（细胞）是现代生物工程中的微型生物反应 器，在强化并维持其最佳生产效能的基础上，从工程菌 （细胞）大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微 型生物反应器的增值速度和最终数量，也是提高外源基 因表达产物产量的主要环节。 二、基因工程基本技术 基因工程的实现主要分为五个步骤： 基因工程的实现主要分为五个步骤： 制备目的基因（切 ）； 将目的基因与载体连接，构建重组DNA（接 ）； 将重组DNA导入受体生物细胞（转 ）； 筛选具有重组DNA的转化体阳性克隆（增 ）； 使目的基因在受体生物细胞中高效表达（检 ）。 （1）从供体细胞中分离出基因组DNA ，用限制性核酸内切酶 （1）从供体细胞中分离出基因组DNA ，用限制性核酸内切酶 分别将外源DNA （包括外源基因或目的基因）和载体分 分别将外源DNA （包括外源基因或目的基因）和载体分 子切开（简称“切” ）； 子切开（简称“切” ）； （2 ）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体 上，形成DNA重组分子 （简称“接” ）； （3 ）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中 （简称“转” ）； 简称“转” ）； （4 ）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合 到受体细胞的基因组中 （简称“增” ）； （简称“增” ）； （5 ）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因 工程菌或细胞 （简称“检” ）。 （简称“检” ）。 可见，基因工程的上游操作过程可简化： 切 接 转 增 检 (一).目的基因的分离制备 目的基因(objective gene)：又叫靶基因(target gene) ，是指根据基因工程的目的，设计的所需要 的某些DNA分子片段，它含有一种或几种遗传信 息的全套密码(code) 。 目的基因主要是编码蛋白质（酶）的结构基 因，如抗逆性相关基因、工业用酶相关基因、生 物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因等。 目前采用的分离、合成目的基因的常用方法有： 直接分离DNA 鸟枪法(shotgun) 基因文库法 酶法或化学方法人工合成基因 mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 1．直接分离DNA 适于遗传背景清楚的细菌染色体 适于分离多拷贝基因 得到的目的基因纯度较低 操作简单，对设备的依赖性低 酶切电泳分离DNA 探针确定、回收特异性片段 2.鸟枪法 随机克隆供体的 全基因组DNA片 段，然后通过快 速有效的筛选程 序从众多克隆中 分离出含有目的 基因的 目的重组 子，进而获得目 的基因。较适于 原菌目的基因的 克隆分离。 鸟枪法克隆目的DNA特点： 适于DNA背景不清时 将完整基因组（genome ）的随