临床基因扩增实验室污染来源监测及防治.pdf

临床基因扩增实验室的 污染来源、监测及防治 检验中心 吕火烊 基因扩增（PCR）实验室污染的来源 • 1.实验环境与实验用品 • 气溶胶 • 离心机 • 移液枪、滴头、离心管等 • 工作服、手套等 • 试剂 • 2.实验操作 • 试剂配制 • 模版提取与加样 • 产物分析（普通PCR ） • 污物处理 气溶胶 • 定义：气溶胶（aerosol）是指悬浮于气体介质中粒径一 般为 0.001μm~1000μm的固体、液体微小粒子形成的胶 溶状态散体系。 • 来源：空气与液体面摩擦。 离心机离心 剧烈地摇动反应管 开盖 吸样时及移液器的反复吸样 污染物的外泄 离心机 1.普通离心机：用于血清或血浆分离 污染原因：离心管盖松落或离心管破碎，产生气溶胶或 溢出，污染同批样本，快速开盖后可污染实验环境 2.生物密闭离心机：用于病原体体的分离及模 版制备 污染原因：离心管盖松落或离心管破碎，产生气溶胶或溢 出污染离心机内腔，污染同批样本，快速开盖后可污染实 验环境 移液枪 1.气溶胶污染 反复吹打标本产生气溶胶污染内腔 2.接触污染 吸样过多，动作过猛 带样本的移液枪平放等 手套及其他 1.手套：重要的污染原，可引起携带污染 2.工作服：污染的工作可产生气溶胶 3.滴头、离心管：被气溶胶污染 基因扩增（PCR）实验室污染的来源 实验操作过程中的污染 1.试剂配制过程 2.模板提取过程 3.模板放置时, 由于密封不严溢于容器外 4.容器外粘有模板而造成相互间交叉污染 5.模板吸取过程中, 因气溶胶（aerosol）或其他 原因引起移液器污染，从而导致交叉污染 基因扩增（PCR）实验室污染的来源 PCR试剂污染 • PCR 试剂配制过程中, 移液器、容器、水等原因 造成试剂被PCR 核酸模板污染。 基因扩增（PCR）实验室污染的来源 PCR产物污染-最主要最常见 • PCR 产物拷贝量大，极微量的PCR产物污染 , 就可形成假阳性。 • 移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支 移液器去准备PCR mix • PCR产物的气溶胶污染： 一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝 基因扩增（PCR）实验室污染的来源 实验室中克隆质粒的污染 • 克隆质粒浓度高, 另外在纯化过程中需用较多 的用具及试剂, 其污染可能性也很大 基因扩增（PCR）实验室污染的监测 PCR强大扩增能力+检测的敏感性 • 经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上 9 可增加10 倍 • 极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造 成很大的问题NTC (No Template Control): 必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中 所有其他成分的对照反应，这一对照管须在准 备好所有其他PCR 以后才进行吸加。 常见的PCR 污染 常规PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NTC 荧光定量PCR NTC 防止PCR污染 首要原则 • 永远要设置NTC对照 如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致 严重的后果：一大段时间的数据不可信 • 准备PCR的移液器要专用 千万不能用吸取PCR产物/克隆质粒的移液器 去准备PCR 体系