生物化学实验自编讲义.doc

生 物 化 学 实 验 绍兴文理学院生命科学学院 二零零八年九月 班级＿＿＿＿＿＿＿＿ 姓名＿＿＿＿＿＿＿＿ 学号＿＿＿＿＿＿＿＿ 目 录 生物化学实验技术发展简史 I 实验一、 考马斯亮蓝染色法测蛋白质含量 1 实验二、 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 3 实验三、 凯氏定氮法测总氮量 4 实验四、 Folin-酚法测定蛋白质含量 8 实验五、 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活力和比活力测定 11 实验六、 硫酸铵分级沉淀分离苯丙氨酸解氨酶 13 实验七、 凝胶层析纯化苯丙氨酸解氨酶 16 实验八、 过氧化物酶活力测定 20 实验九、 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析过氧化物酶同工酶 23 实验十、 底物浓度对酶促反应速度的影响 28 实验十一、血清胆固醇的测定 30 实验十二、还原糖和总糖的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法） 32 实验十三、油料作物脂肪抽提和含量测定 35 实验十四、蔬菜和水果中L-抗坏血酸的测定 36 实验十五、酵母RNA的提取及鉴定 38 实验十六、定磷法测定核酸浓度 39 实验十七、脱氧核糖核酸的琼脂糖凝胶电泳 43 实验十八、纸层析法分析生物体内的转氨反应 47 附 录 51 nm，由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲合力，通过疏水键与蛋白质结合，当它与蛋白质结合形成蛋白质-染料复合物后，其最大吸收波长从464nm移到595nm处。 在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物595nm处的光吸收与蛋白质量成正比。故可用于蛋白质测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2分钟左右达到平衡，其生成的复合物在1小时内保持稳定。该反应非常灵敏，蛋白质最低检测量为5ug，而且此法操作方便、快速，干扰物质少，所以是一种比较好的蛋白质的定量测定方法。 试剂和器材 1、试剂 牛血清白蛋白标准液（100ug/ml） 精确称取0.010g牛血清白蛋白，溶于约50ml蒸馏水，定容到100ml. （2） 考马斯亮蓝G-250试剂 取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%正磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，此试剂在常温下可放1个月。 2、器材 722型分光光度计 离心机 研钵 容量瓶 100ml*1 刻度吸管 1ml*2 5ml*1 试管 8支 三、材料 绿豆芽 操作方法 样品液的制备 称取新鲜绿豆芽下胚轴2g于研钵中，加蒸馏水4ml，匀浆，转移到离心管中，再用50ml蒸馏水分三次洗涤研磨，洗涤液一并收集于离心管中，放置半小时至1小时以充分提取，在4000rpm离心10分钟，弃去沉淀上清液转入100ml容量瓶，以蒸馏水定容到100ml待测。 标准曲线制作及样品测定 取8试管，按0~7编号。 各管如表2-1所示操作。 表2-1标准曲线的制作和样品的测定 　 0 1 2 3 4 5 6 7 100ug/ml牛血清 蛋白标准液(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 样品待测液(ml) 0.5 0.5 蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.5 0.5 考马斯亮蓝G-250 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 　各管均匀，室温下放置5分钟，在λ=595n处比色 吸光度（OD595） 蛋白质含量（ug） 0 20 40 60 80 100 　 A595 结果计算 以蛋白质含量（ug）为横坐标，OD595为纵坐标，在方格纸上绘制标准曲线。 根据样品管（6、7号）OD值的平均数（A 595），从标准曲线中求得蛋白质含量微克数（Y）。 计算样品（绿豆芽）中的蛋白质的含量。 4、样品蛋白质含量（ug/g鲜重）= 思考题 试分析本法的缺点。 实验二、 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 目的要求 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。 原 理 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。 醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120μm，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白，糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。 试剂和器材 1、试剂 巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）1000ml；巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，加水至1000ml。 染色液； 含氨基黑10B 0.25g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，水40ml（可重复使用）。 漂洗液 2000ml；含甲醇或乙醇45ml、冰醋酸5ml、水50ml。 透明液；含无水