第五章 蛋白质和氨基酸的测定第一节 概述.pptVIP

第七节 氨基酸的分离与测定 一．薄层色谱法（薄层层析法（TLC 法） Thin Layer Chromatography 简介： 近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。 （一）原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。 Rf = a / b a b 样点 溶剂前沿 点样原点 优点： ① 展开时间短，一般在20—30分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。 ② 层析后得到的斑点小而清晰。 ③ 能够使用多种显色剂。 ④ 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10—100倍） 精确到0.01ug。 ⑤ 也可用于大量分离＞500 mg，作为样品制备层析。 缺点：Rf值重现性比纸上层析差。 分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。 （三）操作方法： ① 薄层板制备 ② 样品液制备 ③ 点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为 原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时 展开，点与点之间间隔1～2cm。 a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一个点干了再点另一个点。 b.用一小直径ф3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到 板子上先挖好一个小洞穴。 ④ 展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度10～30°，下端浸入展开剂1cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。 a.展开剂的有关情况：主要是低沸点的2～3种有机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的，吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择。 b.展开剂的选择方法： Ⅰ.微量圆环法。 Ⅱ.用小载波片试验，微量展开剂展开5cm。 Ⅲ.图解法： 样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。 样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。 有机溶剂极性由小到大为： 石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。 c.展开的方式： 上行法、下行法、双向展开、单向多次展开、双向多次展开。 双向展开： ⑤ 显色： a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。 b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。 c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。 （涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中） 定性：在同一块板上，同等条件下操作，被测样与标准样同时展开、显色，同 Rf 值即是； 查手册找相同的 Rf 值。 定量：a.目视定量法：以标准斑点对照，相当于样品斑点中含量ug数。 b.斑点面积定量法。 c.将样点取下来，定容，离心，比色。 d.利用薄层色谱扫描仪： 例：日本岛津 CS——910 型双波长薄 层色谱扫描仪 介绍离心薄层色谱仪： 1. LBG — 1型离心薄层色谱仪 北京产 2. 7924型离心薄层色谱仪 美国Harrison 公司研制 3. CLC — 5型离心制备液体色谱仪（日本日立公司，带紫外检测器、记录器和自动收集器，制备量可达 10g 。 二．氨基酸自动分析仪法 三．气相色谱法 四．高效液相色谱法 10-3 第十章的重点 凯氏定氮法原理、分步、测定方法。 双缩脲法测定原理。 氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。 TLC法原理、方法，Rf值的作用及计算方法。 第五章 蛋白质和氨基酸的测定第一节 概述 1. 蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。 食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。 蛋白质是生命的物质基础，人