20071016-质粒DNA的提取及定量定性分析.pptVIP

QA 关于PCR结果分析 关于产物回收①漂洗作用：换缓冲液，除杂②乙醇：保存目的产物③离心：去乙醇，除液体，保证后续工作④补救：勿轻易弃置； 高盐结合，重复漂洗。 关于………… 质粒DNA的提取及其定性定量分析 主要内容 一、质粒DNA提取 二、琼脂糖电泳鉴定及半定量 三、紫外吸收定量及纯度检测 基本原理 结构差别 分子量差别 变性－复性 一、质粒DNA的提取流 程 二、质粒DNA的电泳 DNA 重 组－酶切和连接 * 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 Fig. 1 Agarose Electrophoresis analysis of the PCR products. Lane 1～Lane 12：products of PCR M：DNA marker （from top to bottom：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp） 引物或其二聚体 问题： ①10泳道：上样错位？错误模板？引入污染？热启动不够？ 回收，重新电泳鉴定。 ②1、12泳道：未加引物或模板。 相邻泳道溢出污染 非特异性！ Good ！！PCR仪中的位置 边缘效应？ ！ 胶融！外溢 胶融！ 基因的克隆与表达专题之二 SDS碱裂解 碱裂解Ⅱ 碱变性 接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mL LB 羧苄（50ug/mL ）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中 ? 370C，190rpm振荡培养过夜 ? 4000rpm、离心1min，收集所有菌体 ? 150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min ? 加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清 接菌 培养 收菌 碱裂解Ⅰ ? 加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性 ? 12000rpm，离心10min ? 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀） ? 12000rpm，离心5min ? 上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀） ? 12000rpm，离心5min ? 复性回收 纯化 上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温 30min ? 12000rpm，离心10min ? 沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心） ? 12000rpm，离心5min ? 沉淀于超净台中风干（5min～20min） ? 沉淀加入20uL RTE，600C水浴30分钟溶解 ? -200C保存 醇沉回收 溶解 保存 离心标识 碱裂解Ⅰ 溶液Ⅰ冰浴 pH 8.0 剧烈振荡 10 min 溶液粘稠混浊 碱裂解Ⅱ 溶液Ⅱ现用现配 切勿振荡！颠倒混匀 T≤ 5min SDS包被 ！！ 复性回收 溶液Ⅲ冰上预冷 切勿振荡！颠倒混匀 15min 仅质粒复性？在哪相？ ！！ 制 胶：1%琼脂糖（20 mL，1xTAE) 缓冲液：1xTAE，130 mL 制 样：质粒DNA 2μL  10xloading 0.5μL Marker：5μL 电 泳：80伏恒压 结果分析：鉴定（定性，纯度）；半定量 测定流程：质粒DNA稀释100倍（用TE缓冲液稀释），总体积300 μ L 检测波长： 定量：C=OD260*50*稀释倍数（ μg/mL ） 纯度指标： 三、质粒DNA的紫外吸收检测 260nm－核酸280nm－蛋白 OD260/OD280 比值范围：…………≥1.8～2.0≥…… 污染成分：蛋白,酚 质粒DNA RNA 下次实验的简介与准备 基因的克隆与表达专题之三 *