SDS电泳技术.docVIP

一 原理 d6 @3 j+ p! t　SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以忽略不计。SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS复合物基本上是相同的，但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 SDS实验操作 ; f9 O5 h1 @. K试剂：$ c( w. B% d+ p% H; e+ k1 c3. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。8 E* 2 [/2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。$ D7 i$ c0 c( d3 j3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。# m2 V2 ^ W q0 U c4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。 [5 p7 @! i: G( o2 y5.??TEMED（四乙基乙二胺）原液。??k4 L* M+ V {2 U# z??N9 r$ V! [6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。2 s! Y. R) u+ O6 W Q9 Y7.??pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。% l. a ]+ z% g1 N6 e% O y) c8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。器材; W- v, ]; ]8 i/ D. V! S7 i　　电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。( h. g/ e9 l3 u2 v$ p0 x样品制备+ l3 x8 H+ K/ M1 Z, H??c　　将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100加热5－10min，离心，取上清点样。+ F5 i* `6 S- k# y% A% X i, W! E电泳3 |+ S% I# p0 [9 G1 D1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；2 [, `3 V i3 m H, L7 C2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；: _9 d+ {3 f b) g$ a$ O3. 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；- z/ g# y. u }4 @8 L! ]??d+ k　　ddH2O? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?3.0 ml/ U7 {: b Y5 @$ z??B/ O% ]. E( R? ?? ? 1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8? ?? ?2.1 ml/ O, `9 L- G4 k1 o2 q7 s5 V: ]4 a+ I? ?? ?30% Acr-Bis? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ???2.8 ml K2 ]$ K??Y* \ `4 k9 L+ A　　10% SDS? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 80 ul; E/ A0 G) g6 h7 _