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双向电泳技术对蛋白质样品的检测 姓名： 学号： 专业： 一 实验目的 1掌握实验原理 2.运用 二 实验原理 三 实验步骤 ’,N-甲叉双丙烯酰胺 0.99g 定容到400ml,过滤，4℃保存。 1.2.5 电泳缓冲液（4*）： Tris base 18.18g Clycine 86.4g SDS 6g ddH2O 1.5L 1.2.6 10%SDS溶液： SDS 5g ddH2O To 50ml 过滤，室温保存。 1.2.7 分离胶配方：（300ml,13.5%） 单体储备液 135ml 10%SDS 3ml 1.5M Tris-Cl pH8.8 75ml 10%过硫酸铵 3ml TEMED 0.12ml ddH2O 90ml 1.2.8 琼脂糖封顶液 电泳缓冲液 100ml 琼脂糖 0.5g 溴酚蓝 200μl 微波炉中加热到琼脂糖完全溶解 1.2.9 染色液 考马斯亮蓝R-250 1g 甲醇/乙醇 450ml 冰醋酸 100ml ddH2O 450ml 每块胶用250ml染色液染色1.5h。 实验设备和仪器 离心管（0.5ml、1.5ml）、量筒（50ml、100ml、1000ml）、磁力搅拌器、移液枪（1000微升、200微升）、IPG固相胶条（pH4-7，17cm）、水化盘、镊子、聚焦盘、盐桥、灌胶板、垫片、电泳槽、电泳仪、保鲜膜、塑料抽提（20*30cm）、扫描仪、milliQ制水仪。 实验操作 3.1 第一向等电聚焦 1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（1%溴酚蓝储液）（不含DTT)，置室温溶解。 2. 在0.5mlEP小管中加入精确称取的0.0015g DTT，加400μl水化上样缓冲液，加处理过的样品100μl，使其终体积为500μl，充分混匀。 3. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7），室温中放置10分钟。 4. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。 5. 当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。加色拉油封闭。 6. 对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序。胶条限制电压50kV。 50V，8h(被动水化)；100V，1h；200V，1h；500V，1h；1000V，1h。逐步升压--聚焦（10万伏）--维持。 3.2 平衡 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。 1. 配制胶条平衡缓冲液A、B。 2. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用去离子水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 3. 将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液A。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 4. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液A。并用滤纸吸取多余的平衡液。再加入胶条平衡缓冲液B，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。 5. 将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×的电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上，用于第二向SDS。 3.3 第二向SDS 1. 配制10%的丙烯酰胺凝胶6块。配250ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1