2010级生物工程一班 李晓萌——酶与酶制剂工艺学大实验.docVIP

本科生课程实验 （ 生物工程 专业 2010 年级 一 班 ） 实验名称 固态发酵法制备α-淀粉酶及其活力测定 姓名 李晓萌 同组人姓名 刘学伟、王晓婷、李艳娟、程瑶、马雪、李丹玉 二○一三年五月 固态发酵法制备α-淀粉酶及其活力测定 概述 （1）利用麸皮和米糠为主要原料，添加豆饼等原料，加水拌成半固体状态，供微生物生长与产酶。通风以满足菌体生长、繁殖及产生代谢产物对氧的需求，是实验室摸索工艺条件的常用方法。 UV-11是我国目前生产糖化酶常用的菌种，在查氏平板培养基上的形态特征是：菌落生长呈扩散形，菌丝白色，有时出现黄色区域，绒状，有明显的辐射状波纹，无渗出液，边缘生长较薄，咖啡色，反面为淡黄色。形态特征是否正常，直接影响酶的产生。 （2）为了适应工业规模的生产，长途运输和长期保存，大多将酶液制成含水5％左右的粉末制剂。酶的提纯方法很多，但基本原则是应在提高比例的同时，尽量获得总活性高的回收率。在工业生产中，常以降低成本、简化工艺、提高产品纯度和质量为前提，采取最佳工艺流程。 α—淀粉酶是一种胞外酶，提纯工艺比较简单。首先可用过滤法除去菌体等杂质，继而对滤液进行浓缩，最后用乙醇将酶沉淀出来。对沉淀物进行干燥，加工便成成品。 （3）1mL液体酶于60℃、pH6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉即为1个酶活力单位，以U/mL(U/g)表示。 2.目的与要求 （1）掌握实验室固态发酵操作的基本步骤； （2）熟练菌种的培养特征以及初步的工艺条件； （3）掌握糖化酶活性的测定方和计算； （4）通过本实验，熟悉乙醇沉淀法提取酶的原理与操作步骤。 3.原理 3.1 固态发酵法制备α-淀粉酶 利用麸皮和米糠为主要原料，添加豆饼等原料，加水拌成半固体状态，供微生物生长与产酶。通风以满足菌体生长、繁殖及产生代谢产物对氧的需求，UV-11是我国目前生产糖化酶常用的菌种，在查氏平板培养基上可生长，α—淀粉酶是一种胞外酶，提纯工艺比较简单。首先可用过滤法除去菌体等杂质，继而对滤液进行浓缩，最后用乙醇将酶沉淀出来。对沉淀物进行干燥，加工便成成品。 3.2 α-淀粉酶活力测定 α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量的麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应消失，呈红棕色，颜色消失的速度与酶的活力有关，故通过固定反应后的吸光度计算其酶的活力。 4.实验器材与试剂 4.1 固态发酵法制备α-淀粉酶 菌种：UV－11曲霉 固体培养基：玉米粉8.0％ 3.2g、豆饼粉8.0％ 3.2g 、细麸皮10％ 4g、粗麸皮28.8g,总计约40g；30℃,水70％～90％，500mL三角瓶、纱布、线绳、天平，10mL吸管；高压灭菌锅；天平；旋转式蒸发器。 在曲霉培养时，生成有机酸，PH降低，酶活性失活，加入碳酸钙磷酸盐调节PH，有利于酶活性的提高。 查氏培养基：硝酸钠3g；磷酸氢二钾1g； 硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g； 氯化钾0.5g；硫酸亚铁0.01g；蔗糖30g；琼脂20g； 蒸馏水1000mL；121℃灭菌20min。 4.2 α-淀粉酶活力测定 试剂 （1） 原碘液 称取碘11g，碘化钾22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL棕色瓶中。 （2） 稀碘液 吸取原碘液2mL，加碘化钾22g，用水溶解并定容至500mL的 于棕色瓶中。 （3） 20g/L可溶性淀粉溶液，称取可溶性淀粉（绝干计） 2.000g.用水调成浆 状物，在搅动下缓缓倾入70mL沸水，然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉 的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却定容100mL。需要当天配 置。 （4）磷酸缓冲溶液 （pH6.0）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）45.23g，柠檬酸（C6H8O7. H2O）8.07g,用水溶解并定容1000mL，用pH计校正。 仪器 分光光度计、恒温水浴、试管、 烧杯、容量瓶 5.实验步骤 5.1固态发酵法制备α-淀粉酶 (1) 培养基灭菌：按固体培养基配好，装入 500mL三角瓶中，加水稍微摇匀。瓶口包扎8层纱布。置灭菌锅，在1Pa（表压）下灭菌30min。 （2）接种：将成熟的斜面，在无菌条件下，分别注入10mL无菌水，振荡成菌悬浮液。待培养基灭菌后冷却到30～32℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中。接种量为2mL。 （3）在30℃恒温培养箱中，培养48～72h，将发酵基质加3倍水搅拌均匀。 （4）过滤和沉淀：用纱布过滤，取清液离心4000r/min 5min,取上清液于锥形瓶中，取100mL上清液加2gα-淀粉酶完全溶解，加100mL乙醇静置5min，离心4000r/min 5min,取沉淀于试管中，称其重量。 5.