第十一讲 PCR技术.pptVIP

分子杂交 一、 Southern杂交 二 、Northern杂交 三、 菌落原位杂交 四 、Western杂交 一、Southern杂交 这种方法是E.M.Southern1975年建立,是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。 1.预处理： （1）用限制性内切酶将基因组DNA进行酶切。 （2）将酶切后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳。 （3）将电泳出来的那块凝胶泡在强碱溶液中，此时双链的DNA样品变成单链DNA结构。 （4）用酸中和，使单链DNA维持其单链状态 2.原位转移： 将凝胶上的单链DNA转移到滤膜上。 3.固定： 在真空烤箱里，80℃下烤1-3h。将核酸样品进一步固定在滤膜上 4.杂交： 将滤膜移在含有放射性同位素标记的探针分子溶液中，溶液上的单链DNA分子与探针分子通过互补配对进行杂交，形成杂种分子。 5.漂洗： 将滤膜上没有和单链DNA样品结合的游离的探针分子漂洗下来，此后滤膜上只有杂交分子。 6.放射自显影： 在X光曝射下进行放射自显影形成自显影图片。 7.比较鉴定： 将放射自显影图片上的谱带与凝胶上的谱带进行比较。确定与探针分子结合的DNA分子是凝胶上DNA链的那个片段。 Southern印迹杂交方法操作简单，结果十分灵敏，在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。 （二）Southern杂交的杂交滤膜 1.硝酸纤维素滤膜 在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它存在一些不足之处: （1）硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的，这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜进程，DNA会慢慢脱离硝酸纤维素滤膜，从而使杂交效率下降。 （2）硝酸纤维素滤膜质地较脆弱，容易碎裂，因此操作须小心谨慎 (特别是经烘烤后)。 （3）硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐浓度时结合DNA效果不佳，不适宜于电转印迹法。 （4）硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段 (特别是小于200bp的DNA片段)结合能力不强。 2. 尼龙膜 优点： 结合DNA和RNA的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合。 尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂交。 缺点： 杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高。 三 菌落原位杂交 （colony in situ hybridization） ●1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根据检测重组子DNA分子的核酸杂交技术原理,对Southern印迹技术作了一些修改,提出了菌落原位杂交技术。该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列的菌落。 四、Western杂交 是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测方法，具有很高的灵敏度，可从总蛋白中检测出50ng的特异性表达蛋白。 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 ◆ Southern印迹法(DNA印迹法,Southern blotting)：是一种把DNA电泳分离区带转移到支持膜上的技术。因这一技术是英国科学家E.M.Southern首先创建的，而且这一转移过程与墨迹被吸印到吸墨纸上的过程相似，所以用他的姓氏命名为Southern印迹法。 ◆ Northern印迹法(RNA印迹法,Northern blotting)：Alwine等人将Southern印迹法应用于RNA，原理与Southern印迹法相似。Alwine等人根据命名Southern印迹法的姓氏中含有“南部” 之意，风趣地把他们的RNA印迹法称为“北部”印迹法（Northern blotting）。 ◆ Western印迹法（蛋白质印迹法，Western blotting）：是一种从混合蛋白质中检出微量特定蛋白质的方法。人们把这种以电驱动为转移方式的蛋白质印迹法诙谐地称为“西部”印迹法（Western blotting）。 ◆ Eastern印迹法（Eastern blotting）：是Western blotting的变形，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法.所谓的双向电泳是先用等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳（