粗蛋白分析.pptVIP

粗蛋白含量的测定（凯氏定氮法） 讲解人:段慧 * * 蛋白质的定量分析是蛋白质结构分析的基础，也是农副产品品质分析，食品营养价值比较、生化育种、临床诊断的重要手段。 现有多种蛋白质的定量法，都是根据蛋白质分子的理化性质进行的。这些方法大体可分为利用蛋白质的共性（含氮量、肽键、折射率等）和利用蛋白质含有特定氨基酸残基（芳香族、酸性、碱性等）两类。 粗蛋白含量的测定 蛋白质的常用定量法 蛋白质定量法 利用特定 氨基酸残基 利用共性 物理法(折射率法、比浊法、放射性同位素法) 凯氏法 双缩脲法 Lowry法 紫外法 色素结合法 比色法 凯氏法是1883年丹麦化学家凯道尔（Johan kjedahl）创造的对蛋白态氮定量的方法，目前在国际上仍被列为蛋白质定量的基准方法。 双缩脲法、Lowry法、紫外法是目前生化领域中使用较多的比色法。 色素结合法是40年代以后发展起来并且仍在急速发展的新的比色法，其灵敏度极高。 蛋白质的常用定量法 每一种蛋白质都有其恒定的含氮量。各种蛋白质含氮量变幅在14%－18%，平均为16%。当样品与浓硫酸加热时，样品中蛋白质的氮变成铵盐状态。在强碱条件下将氨蒸出，用加有混合指示剂的硼酸吸收蒸出的氨。以标准盐酸或硫酸滴定吸收的氨，恢复硼酸吸收氨之前原有的氢离子浓度。根据标准酸消耗量，即可算出氮量，再乘以16%的倒数即6.25，可求出样品中蛋白质的含量。 。 一、凯氏定氮法原理 一、凯氏定氮法原理 1.日本 VS－KTP自动定氮仪 2.红外温控定时消解炉 3.样品粉碎机 4.玻璃消解管 5.硼酸（A.R） 6.甲基红 7.亚甲基兰 二、仪器和试剂 三、测定步骤 上机测定 消解 称样 在样品消解时为定氮仪添加试剂： 标准酸、氢氧化钠 硼酸、 混合指示剂 输入有关参数 水、加碱量、蒸馏时间 换算系数、称样量等 三、测定步骤 1.称样 取0.1~0.5g粉碎均匀的样品或吸取液体样1~5ml，分别置于三支消解管中，加入催化剂（硫酸钾与硫酸铜为9:1）1.5~2g，加入浓硫酸3~5ml。 * 含硝态氮的样品须处理，称样0.1g，加入含水杨酸的硫酸3ml，放置30分钟后，再各加0.1g锌粉，最后再加2ml H2O，放置10分钟后，加入催化剂。 ** 样品处理注意事项 1.称样一定要精确，样品一定要均一，因为此方法用的是半微量凯氏定氮法，样品用量较少。 2. 为防止样品粘在管壁上，应采用称量纸包样，直接将投入消煮管底部，做空白时，带上称量纸，抵消其影响。 2.称样量大小决定于各类样品的含氮量。如健壮茎叶干样含氮约1~5%，称样应为0.2g，老熟秸秆干样含氮约0.4~0.6%，称样量为0.5g，种子干样含氮约1~4%，称样量应为0.2~0.5g，新鲜的茎叶样品可按干样称量的5倍称取。 ** 样品处理注意事项 4.浓H2SO4的用量主要取决于称样的干物质的重量。小于1g的干物质至少加3~8ml H2SO4，每增加1g干物质需增加6~12ml H2SO4。 5.如果条件允许的话，样品加酸以后浸泡2小时或者过夜更好。 三、测定步骤 * 消煮的温度不能超过410℃，否则将会引起氮的损失。 2. 消解 将上述样品置红外消解炉上200℃ 30分钟，直到样品中没有大的结块，400℃ 30分钟，消解后溶液呈清亮的蓝绿色 三、测定步骤 3.为定氮仪添加试剂 (1).配制经标定的标准酸（硫酸或盐酸）浓度为0.01~0.05mol/L放入盛标准酸的容器中。 三、测定步骤 (2).将配制好的30%氢氧化钠溶液置入塑料碱桶中。 三、测定步骤 (3).将配制好的3%的硼酸按100:1的比例加入混合指示剂（A液：0.2%甲基红无水乙醇；B液：0.1%亚甲基兰无水乙醇溶液；两溶液以1:1混合后加入），溶液配好后置于棕色瓶中。 三、测定步骤 4.输入有关参数 打开仪器的电源开关，通入冷却水以及供锅炉使用的去离子水，输入有关参数（如水、加碱量及蒸馏时间，换算系数、称样量等） 参数输入 三、测定步骤 5.加样 将已消解好的样品放入蒸馏室，即可自动蒸馏、滴定、比色、换算结果）。 蒸馏系统 蒸馏头 蒸馏管 计算系统 比色滴定系统 打印系统 四、结果计算 V—— 样品所耗标准酸体积(ml) V0——空白所耗标准酸体积(ml) 标准酸浓度(mol/L) 6.25——含氮量换算为蛋白质含量的系数