粪便涂片法检查菌群失调标准操作规程.docVIP

粪便涂片法检查菌群失调标准操作规程 一、革兰染色液的配制（科氏改良法） 共5种液体，分为结晶紫A液，结晶紫B液，革兰碘液，脱色液，复染液。 染液名称 配制方法 1结晶紫A液 结晶紫0.25g（研磨后），加乙醇（2ml，95%），再蒸馏水98ml 2结晶紫B液 Na2CO3 1.25g，加蒸馏水100ml 3革兰碘液 NaOH 0.1g溶于2.0ml蒸馏水中，加I2 2.0g ， KI 4.0g，再加蒸馏水至100ml 4脱色液 丙酮30ml+乙醇70ml（95%） 5复染液 沙黄2.5g~3.0g加入乙醇（95%）10ml，溶解后加入蒸馏水100ml（或用10%石炭酸复红液10稀释即可） 二、涂片制作 1、取样： 粪便标本送检时，观察标本性状，并“多位点”挑取或沾取粪便标本； 2、推片与固定： 以30~40度角推片，面积1~1.5×2cm，自然干燥后，酒精灯上火焰上能过3次固定（制作涂片2张，其中作为一张备用）； 3、染色： 第一步，先加A液淹没标本，再加“等量”B液混合，染色1分钟；水轻柔冲洗掉； 第二步，加革兰碘液，1~2分钟；水轻柔冲洗掉； 第三步，加脱色液20秒到30秒，根据情况而定，如涂片稍薄时就适当减少染色时间；水轻柔冲洗掉； 第四步，最后复染30秒，冲洗后晾干或吸干。 4、涂片制作注意要点： 1、涂片不可太厚，亦不可太薄，太厚则细菌总数增加，且影响观察，太薄则涂片所见细菌总数减少，厚薄如血膜为宜。 2、注意把握染色时间，好的染色是能够清晰准确观察的必要条件。 三、镜下观察 1、确定涂片和染色情况：涂片要均匀，菌体不变形，革兰阳性和革兰阴性反差要好。 2、总览细菌总数：观察总数的多少，以及有无优势菌或真菌等。其评定标准见《肠道粪便检查图谱》。 3、观察G+杆菌、G+球菌、G-杆菌、G-球菌比例：选定有代表性的视野，计数并判定其大概比例（有经验者可根据经验判定）。计数方法可选用纸片打孔缩小视野计数法来计数；亦可选定有代表性视野，数一定数量的细菌，再计数各种比例。 四、结果判定: 请按照下表进行参照填写每个患者的菌群失调化验单（四联活菌肠溶胶囊临床试验专业） 正 常 参 考 值 评 定 参 考 标 准 分 析结 果（检验师填写） I 度失调 Ⅱ度失调 Ⅲ 度失调 大便性状 正常成形或成型软便 正常成形或不成形软便、稀便 多数为程度不等的稀便，也可为粘液便、水样便、脓血便或柏油样便 多数为程度不等的稀便，也可为粘液便，常呈黄绿色或黑色 涂片所见 细菌总数 500～5000/油镜视野（计数5个油镜视野细菌数的均值） 细菌总数在正常范围（501~5000/HP）、正常低值或略有减少（101~500/HP） 细菌总数明显减少（11~100/HP）或无明显改变 细菌总数呈显著减少（＜10HP） 革兰阳性杆菌 50.2%-74% 革兰阳性杆：革兰阴性杆：革兰阳性球：革兰阴性球= 50-74： 35-44： 2-10： 0.5-5 正常范围低值 革兰阳性杆：革兰阴性杆：革兰阳性球：革兰阴性球 = ≤50：45-50：13-30：5-10 明显减少 革兰阳性杆：革兰阴性杆：革兰阳性球：革兰阴性球 = 35-40：＞50：＞30：＞10 细菌总数呈显著减少，粪便中原来的菌群大部分成员被抑制而消失 革兰阴性杆菌 35.29%-44% 多数会稍有增加 革兰阳性球菌 2%-10% 正常范围高值或增多 革兰阴性球菌 0.5-5% 杆菌：球菌≧ 3:1 （杆菌＝革兰阳性杆菌＋革兰阴性杆菌） （球菌＝革兰阳性球菌＋革兰阴性球菌） 1:1～2:1 可能会出现比例倒置 镜下印象： 1. 肠道菌群未见明显异常 2. I度菌群失调改变 3. II度菌群失调改变 4. Ⅲ度菌群失调改变 五、其它说明： 1、尽量用新鲜粪便进行检测，时间半小时之内，如果耽搁时间较长，可以取稍微量多的粪便样本，取样时挑取中心位置的粪便。 2、遇粘液便，胨样便或水样便亦可采用牙签进涂片。 3、镜检时，应将涂片视野全面观览，不可只看几个视野就计数或报告，以防误差。 六、参考文献： 张秀荣. 肠道菌群粪便涂片检查图谱[M]北京：人民军医出版社2000.1-25. 制作：杭州龙达新科生物制药有限公司研发部 日期：2008年4月 口服四联活菌肠溶胶囊临床研究SOP 第 1 页 共 3 页