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细菌染色技术 (2010-11-22 22:29:46) 目的要求 初步掌握细菌涂片制作，单染色法及革兰染色法等染色技术。 实验内容 1．细菌染色一般程序 涂片 干燥 固定 初染 (媒染) 脱色 复染 (1) 涂片 临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上，固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水，然后取菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。 (2)干燥 涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。 (3)固定 细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3～5次，温度以手能摸时热而不烫为度。目的在于杀死细菌，凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性。 (4) 初染 不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆盖菌膜为度。 (5) 媒染 通过媒染可增加染料和被染物质的亲和力。媒染剂还可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。 (6) 脱色 此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。 (7) 复染 细菌初染色被脱色后常以复染液复染，便于观察。复染液的颜色与初染液有明显不同。 2．常用染料原液配制 一般制备100ml纯酒精饱和溶液所需染料量：美兰2g～5g；结晶紫7g～14g；碱性复红3g～7g。 3．常用的染色方法 (1) 单染色法 即用一种染料染色的方法。常用吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液。 1) 染液 ① 吕氏美兰液 美兰酒精饱和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成。 ② 稀释石炭酸复红液 碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸馏水作10倍稀释即成。 2) 菌种 大肠埃希菌普通斜面培养物。 3) 染色方法 于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液，染色1min，以水冲洗至无颜色流下为止，自然干燥或以远火烘干后镜检。 4) 结果 以美兰染色者菌体呈现兰色；以稀释石炭酸复红染色的菌体呈现红色。 (2) 革兰染色法 1) 原理 细菌被结晶紫着色后，再经媒染剂处理，染成深紫色或紫黑色。如被酒精脱去颜色，经复红复染成红色，称为革兰阴性菌；如不被酒精脱色，则仍为紫黑色，称为革兰阳性菌。 革兰染色的原理尚未完全明了，主要有三种学说：① 等电点学说 革兰阳性菌的等电点低(pH2～3)，革兰阴性菌等电点较高(pH4～5)，一般染色液pH值为7.0左右，故电离后阳性菌所带阴电荷比阴性菌多，因此，摄取带阳电荷的染料（如结晶紫）多且不易脱色。② 通透性学说 革兰阳性菌细胞壁的通透性比阴性菌小，脱色剂较易通过革兰阴性菌的细胞壁，将染料溶解洗出，故易脱色；阳性菌的细胞壁通透性低，故不易脱色。③ 化学学说 革兰阳性菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它能和染料-媒染剂互相结合，使已着色的细菌不易脱色；革兰阴性菌体含核糖核酸镁盐复合物较少，易被脱色。 2) 染液 ① 结晶紫染液 取结晶紫饱和溶液20ml+1%草酸铵水溶液80ml混合过滤。 ② 卢戈碘液 取碘化钾2ml以10ml蒸馏水充分溶解，然后加碘1g待完全溶解后加蒸馏水至300ml。 ③ 脱色剂 95%乙醇。 ④ 稀释石炭酸复红 同单染色法。 3) 菌种 大肠埃希菌和葡萄球菌混合菌液。 4) 方法 ① 初染 将结晶紫染液2～3滴加于制好的涂片上，染色 1min，水洗； ② 媒染 加卢氏碘液2～3滴染色1min，水洗； ③ 脱色 95%乙醇脱色0.5min(无紫色脱落为止)，水洗； ④ 复染 加稀释石炭酸复红数滴，染色1min，水洗干后镜检。 5) 结果 革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌染成红色。 6) 注意事项 ① 涂片不宜过厚，否则脱色受影响，使革兰阴性菌染成革兰阳性菌，造成错误鉴定。② 为防止染液蒸发而改变浓度，碘液的颜色变淡应弃去。③ 涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果，故每次水洗后应将玻片甩干。④ 注意细菌的菌龄，一般以18h～24h左右培养物效果最好，菌龄过长影响细菌染色性。 (3) 萋-纳抗酸染色法(ziehl—neelsen)：主要用于结核杆菌和麻风杆菌检查。 1) 染液 ① 石炭酸复红染液 取碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸水溶液90ml混合。 ② 脱色剂 3%盐酸酒精。 ③ 复染剂 吕氏美兰染液，同单染色法。 2) 菌种 卡介苗和表