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细菌染色技术 基础生物学实验（三） 目的要求 学习微生物涂片，染色的基本技术，掌握细菌的染色法。 初步认识细菌的形态特征。 巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。 微生物染色的染料 是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。 染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类。 在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性紫复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料。 微生物染色原理 在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷； 而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷； 带正电荷的碱性染料染色部分很容易与带负电荷细菌细胞结合使细菌染色。 材 料 菌种 染色剂 仪器或其他用具： 显微镜 酒精灯 载玻片 接种环 香柏油 酒精+乙醚 擦镜纸 生理盐水等。 简单染色方法 革兰氏染色 菌种: 参考菌：G+：Staphylococcus aureus, G-: Escherichia coli 仪器 显微镜； 材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。 染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液； 革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较 成分 占细胞壁干重的% 革蓝氏阳性菌 革蓝氏阴性菌 肽聚糖 含量很高（50-90） 含量很低（~10） 磷壁酸 含量较高（50） 无 类脂质 一般无（ 2） 含量较高（~20） 蛋白质 无 含量较高 革蓝氏染色的意义 细菌分类鉴定 指导临床用药 微生物分类鉴定的特征 形态学和生理生化特征 血清学实验和噬菌体分型 氨基酸序列和蛋白质分析 核酸碱基组成和序列分析 形态学特征 培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表面特征、光泽等 细胞形态：形状、大小、排列方式 特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、荚膜等 细胞内涵物 染色反应：革蓝氏染色、抗酸性染色 运动性 方法 涂片 初染 媒染 脱色 复染 镜检 涂片 要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色; 注意练习无菌操作； 在载玻片上滴半滴生理盐水； 取菌不要贪多，接种环上肉眼可见菌苔痕迹即可； 菌苔在生理盐水中涂片要均匀，局部不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。 ⑴初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。 ⑵媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。 ⑶脱色 滴加95%乙醇，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。 ⑷复染 滴加蕃红，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。 干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G?)；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。 作业 实验报告 1、涂片 取一块干净的载玻片平放在载玻片架上，在载玻片中央滴一滴生理盐水（或蒸馏水）； 无菌操作从试管中生长有琼脂斜面上挑取少许菌苔； 将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。 注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 2、干燥 将涂好菌膜的载玻片平放在载玻片架上，室温下自然干燥。 3、固定 手持已经自然干燥的涂好菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，热固定细菌细胞。 原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固、使细菌细胞质凝固，从而固定细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。 4、染色 将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 染色时间： 吕氏碱性美蓝染色1~2min； 石炭酸复红染色约1min 草酸铵结晶紫染色约1min。 5、水洗 将细菌涂片上染液倒入废液缸中； 手持细菌染色涂片，置于废液缸上方，用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无色为止。 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。 6、干燥 自然干燥：将染好色的细菌涂片平放在载玻片架上，室温下自然干燥； 吹干：将染好色的细菌涂片平放在载玻片架上，用电吹风冷风或低温热风吹干； 吸干：将染好色的细菌涂片平放在一张吸水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。 7、镜检 涂片干后镜检。 注意：涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。 防止水的折射，以便于观察。 Microbiological Sterile Techniques 球菌 杆菌 杆菌 螺菌 *