细菌的革兰氏染色.pptVIP

实验三 细菌的革兰氏染色 （Gram stain） 一、目的要求 了解革兰氏染色的原理； 学习并掌握革兰氏染色的方法。 二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。 它是1884年由丹麦医师Gram创立的。 革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。 碱性染料初染液——结晶紫（crystal violet） 媒染剂——碘（iodine） 脱色剂——95％的酒精（ethanol） 复染液——番红 三、实验器材 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、未知菌； 草酸铵结晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，载玻片，显微镜等。 四、实验步骤 1．涂片：将培养24小时的大肠杆菌和未知菌，培养12-18小时的枯草芽孢杆球菌、分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1～2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2．染色 （1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 （3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染：用番红液染1～2分钟，水洗。 （5）干燥和镜检：干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 （6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 1．结果 列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌的染色反应，并判断它们分别是G-或G+. 2．思考题 （1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？ （2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？ * * * 肽聚糖(peptidoglycan) 革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥 青霉素作用点 溶菌酶作用点 N-乙酰葡糖胺 N-乙酰胞壁酸 革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链 肽聚糖(peptidoglycan) 革兰阳性菌细胞壁特殊组分 壁磷壁酸 膜磷壁酸 革兰阴性菌细胞壁特殊组分 革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较 + — 脂多糖 + — 脂蛋白 + — 外膜 — + 磷壁酸 占细胞壁干重5%-20% 占细胞壁干重50%-80% 肽聚糖含量 1-2层 可多达50层 肽聚糖层数 10-15nm 20-80nm 厚度 较疏松 较坚韧 强度 革兰阴性菌 革兰阳性菌 细胞壁 大肠杆菌革兰氏染色 炭疽芽胞杆菌 五、实验报告 * *