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聚丙烯酰胺凝胶电泳法实验二、血清蛋白的分离——聚丙烯酰胺凝胶电泳法 目的要求 (1) 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。 (2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。 Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的Acr、Bis 、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有圆盘（disc）和垂直板（vertical slab）型之分，但两者的原理完全相同。由于垂直板形具有板薄，以冷却，分辨率高，操作简单，便于比较与扫描的优点，而为大多数实验室采用。 试剂和器材 一、试剂 分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。 浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。 电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6g, 甘氨酸28.8g, 用无离子水溶解后定容至1L。用时稀释10倍。 30％Acr－Bis贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。 TEMED；10%过硫酸铵（新鲜配制）；25%蔗糖溶液；0.05%溴酚蓝溶液；7%冰乙酸溶液。 染色液：称取考马斯亮蓝R250 2.5g，冰乙酸92ml，甲醇454ml，加去离子水454 ml使其完全溶解，过滤后置棕色瓶保存。 脱色液：取甲醇50ml，冰乙酸75ml，加蒸馏水至1000ml。 二、材料 人或动物血清。 三. 器材 DYCZ-24D型垂直板电泳槽；移液管1 mL（′ 3），5 mL（′ 4），0.5mL（′ 1），0.1mL（′ 2）；烧杯100mL（′ 2）；细长头的吸管；微量注射器。 操作方法 一、 安装垂直板电泳槽 1. 将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠； 2．用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，玻璃室凹面朝外，插入斜插板； 3．用蒸馏水试验封口处是否漏水。 二、 制备凝胶板 1．分离胶制备：取Acr-Bis储备液 5.0mL, Tris-HCl缓冲液 PH8.9 2.5mL, 去离子水12.39mL, TEMED 0.02mL置于小烧杯中混匀，再加入10% 0.1mL过硫酸胺，用磁力搅拌器充分混匀2min。混合后的凝胶溶液，用细长头的吸管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。 用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水（约3－4cm），用于隔绝空气，使胶面平整。分离胶凝固后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。倒掉重蒸水，用滤纸吸去多余的水。 2. 浓缩胶制备：取Acr-Bis储备液1.0mL， Tris-HCl 缓冲液（PH6.7）1.25mL，TEMED 0.01mL, 去离子水7.64mL，10% 过硫酸胺0.1mL，用磁力搅拌器充分混匀。混合均匀后用细长头的吸管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。待浓缩胶凝固后，轻轻取出样品模槽板，用手夹住两块玻璃板，上提斜插板，使其松开，然后取下玻璃胶室去掉密封用胶框，用1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。插入斜插板，将电泳缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，外槽缓冲液加到距平玻璃上沿3mm处。 三、加样 取0.1mL血清样品, 0.1mL 25%蔗糖溶液, 0.05mL 0.05%溴酚蓝溶液混合后，用微量注射器取5μL上述混合液，通过缓冲液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 四、电泳 将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离较时，将电流调至20－30mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 五、染色 将凝胶放入考马斯亮蓝R250染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右。 六、脱色 弃去染色液，将凝胶置于脱色液中，并经常更换