质粒提取、定量与酶切鉴定.pptVIP

琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶的制备 上样：加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀 电泳 ：电压100v；30min 结果观察：凝胶成像仪　 向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可； 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子； 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀； 上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为6 μl ； 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳； 电泳条件：电压80v；时间25～30分钟； 电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带 13. 取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。 琼脂糖凝胶电泳上样 1：DNA Marker（ 5 ?l ） 2：提取的质粒DNA （ 5 ?l ） 3：质粒DNA酶切产物 （ 10 ?l ） + - 1 2 3 4 每组上2个样品 DNA Marker (ladder) 　 Loading Buffer上样缓冲液 EDTA 甘油 ……………增大溶液密度 溴酚蓝…………指示剂 二甲苯胺蓝……指示剂 组成 0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中， 迁移率 溴酚蓝=300bp 二甲苯胺蓝=4kbp 染色 溴化乙锭(Ethidium　Bromide，EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入DNA分子碱基对之间并与之结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光, 优点：染色操作简便，快速；灵敏度高 缺点：有致癌性(使用时一定要戴手套) 1 2 M 3 4 5 6 7 5000 3000 2000 1000 … bp M: DNA Marker DL5000 PCR 产物; 2. PCR 产物 3. 质粒DNA; 4. 质粒 DNA 5. 酶切产物; 6. 酶切产物 结果分析 * 载体的标准：（1）能自主复制；（2）具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；（3）有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；（4）分子量小，以容纳较大的外源DNA。 * 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需) 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求 * 质粒的提取——碱裂解法（碱变性法） 溶液1 破裂细胞 溶液2 DNA变性 溶液3 质粒DNA复性 * 另一种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。 注： A 值的测定受溶液pH值的影响。因此，一般在中性pH条件下进行测定。 这种方法常用于测定比较纯的样品。 在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。 EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐Ethidium　Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。 EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。 SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样 品中，价格较昂贵。 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS及高浓度NaCl等均能抑制酶反应 反应系统：反应缓冲液的主要成分是Tris-Cl、NaCl和Mg2+,离子强度合适可以激发酶切反应，反之会抑制甚至导致酶识别活性的丧失。 反应体积：一般应尽量小，但由于酶的储存液是在50%甘油中，甘油会使很多酶的识别特异性下降，故酶切反应中甘油浓度应低于5% 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误，延长酶切时间可使所需酶量减少。 DNA的pI约为4-5，