仪器分析第三章.ppt

高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 HPLC与GC差别 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80% 2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） §3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比） 2）涡流扩散项及其影响 3）传质阻抗项及其影响 1． 1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 约1ml/min 3. 柱温的选择： 选室温250C左右 反相键合相固定相 1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑ ， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓ 2．固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题） 3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF 正相键合相色谱 4．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 5．出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题） 4．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱极性大的组分后出柱 6．适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等 §3-5 液相色谱法流动相 选择流动相时应注意下列几个因素。 流动相纯度　 （使用色谱纯试剂） 应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样要有适宜的溶解度 溶剂的粘度小些为好 应与检测器相匹配 §3-6 高效液相色谱仪 4．色谱柱： 常用的标准柱型是内径为 4.6 或 3.9mm ，长度为 15 ～ 30cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度 5 ～ 10μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000 ～ 10000 。 柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） 柱再生：维护、保养、柱子的冲洗 §3-7 高效液相色谱分离类型选择 §3-9 液相制备色谱 制备色谱：是以色谱技术来分离、制备大量纯组分的方法。 液相制备色谱优点： 分离条件较温和、分离检测中通常不导致试样破坏，试样易于回收。 3、液相制备色谱仪 1．高压泵：要求流量稳定、平稳、无脉动。 直接影响柱效，峰面积重现性和定量分析的精密度。 恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用 （１