吸光光度法 - 食品伙伴网.ppt

Analytical chemistry 吸光光度法 2003年5月 比色及吸光光度法 教学指导： 吸光光度法简介 吸光光度法基本原理 可见分光光度法及其仪器 吸光光度法应用 第一节 吸光光度法简介 吸光光度法（Absorption Photometry）：基于物质对光的选择性而建立的分析方法。 包括比色法、紫外可见分光光度法、红外分光光度法。 广泛用于无机物和有机物的定性和定量分析。 目视比色法→光电比色 分光光度法特点： 灵敏度高：试样中1%-0.001%微量成分 准确度较高：相对误差2%-5%（1%-2%）。； 几乎所有的无机离子有许多有机化合物； 操作简便、快速、仪器价格适中、用途广。 第一节 吸光光度法简介 一、光的基本性质 1、光的波粒二象性 波动性：光以波的形式传播，可用波长、频率来表示。 波长? ：两个相邻波峰或波谷间的距离（nm） 频率? ：单位时间里通过一固定点处波的数目（s-1） ?=c/? 光速c= 3×1010 cm/s 第一节 吸光光度法简介 粒子性：光由光子组成，具有能量。 △E = h?=hc /? h为普朗克常数 6.63×10-34J.s 2、光谱分区 二、物质对光的吸收 1、物质对光选择性吸收的实质 一束光通过某物质时该物质的分子、原子或离子与光子发生碰撞，光子的能量转移至分子、原子或离子上，使这些粒子发生能级变化，由基态跃迁至较高能态，这个过程即为吸收。 光是否被物质吸收，取决于 光子的能量 物质的结构 只有当能级差△E 与光子能量h?相当时物质吸收光。 2、物质的颜色与光吸收的关系 复合光与单色光 单色光：具有单一波长的光。 复合光：由不同波长的单色光按一定比例组成的光 如白光。 溶液颜色与光吸收的关系 溶液对光的吸收：若溶液透明、均匀，人眼看到的溶液颜色是由透射光的波长决定的。当入色光为白光（复合光），溶液吸收的光与透射的光互补。 互补色：组成白光的两种光。 溶液颜色与吸收光颜色和波段的关系 3、吸收曲线（吸收光谱） 吸收曲线：吸光度随波长变化的曲线。 吸收曲线的特点： 不同的物质因其分析结构不同而具有不同的吸收曲线； 同一物质，浓度不同，其吸收曲线的形状和λmax的位置不变，但在同一波长下吸光度随浓度的增大而增大。 吸收曲线是吸光度法选择测量波长的依据。 第二节 吸光光度法基本原理 朗伯—比耳定律 吸光度A：表征物质对光吸收程度的量。 A= lgIi/I0 = -lgT =?bc A--吸光度 ?--摩尔吸光系数 C--被测物浓度 Ii--入射光强 朗伯—比耳定律适用条件： 入射光为平行单色光，且垂直照射； 吸光物质为均匀非散射体系； 吸光质点之间无相互作用； 辐射与物质之间的作用仅限于光吸收过程，无荧光和光化学现象； 吸光度具有加和性（A总=A1+A2+ …）。 。 工作曲线图 工作偏离图 偏离原因： 非单色光引起的偏离：L—B定律要求入射光为单色光，但目前仪器提供的入射光是由波长范围较窄的光带组成的复合光。 非平行入射光引起的偏离 介质不均匀引起的偏离 化学因素引起的偏离：高浓度时引起溶液中吸光粒子之间相互作用上升，使吸光能力发生变化；化学反应引起的偏离。 第三节 可见分光光度计 1、光源 基本要求： 在仪器工作的波长范围内，提供连续、有足够发射强度和良好稳定性的复合光，而且发射光的强度随波长的变化应尽可能小。 常用光源：钨丝灯和卤钨灯，可使用的波长范围在360 ~2500nm。 2、单色器 单色器作用：从光源发出的复合光中分出所需要的单色光。 单色器组成：由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等组成。 单色器的核心部分是色散元件（如玻璃棱镜和光栅），起分光的作用。 3、吸收池 4、检测器 分光光度计的使用 分光光度计的保养与维护 安置在干燥、无污染的地方； 仪器内的防潮硅胶应定期更换或再生； 仪器停止工作时，必须切断电源，应按开关机顺序关闭主机和稳流稳压电源开关； 比色皿使用完毕后，立即用蒸馏水或有机溶剂冲洗干净，并用柔软情节的纱布把水渍擦净； 仪器经过搬动，请及时检查并纠正波长精度。 第四节 吸光光度法应用 吸光光度法主要应用于微量和痕量组分的测定，有时也用于某些高含量物质的分析。近年来用于多组分物质的分析、配合物的组成和稳定常数的测定等。 1 邻二氮菲法测定微量铁 (邻二氮菲法主要用于测定铁) 　试样经溶解、分离干扰物质后，在试液中加入盐酸羟胺将铁全部还原为Fe2+，加入邻二氮菲显色剂，并加入HAc-NaAc缓冲溶液，pH约为4.0~5.0，显色3~5 min后，以试