细胞生物学实验5.ppt

实验三 细胞器的分离 分离出纯的亚细胞组分，是对细胞的结构及功能进行研究的重要研究手段之一。这种拆离的方法，使细胞中的各种生物学过程彼此分开，互不干扰，便于确定一种复杂过程中的细节，从而深化我们对细胞整体功能的认识。 分离亚细胞组分的方法主要有差速离心和密度梯度离心。差速离心适于分离密度和大小有显著数量级差别的颗粒，用在分离细胞器是成功的也是最常用的。对于精细的分步分离，则密度梯度离心效果更好，但制备介质梯度比较费时。 实验目的 了解细胞器分离的基本原理， 掌握操作方法。 离心场一般可用相对离心场RCF，即重力常数g（980cm／s2）的倍数来表示，因此公式1又写作 在离心的同一时刻，密度和大小不同的球形颗粒将处于介质的不同高度位置。 这样，如果依次选用不同的离心场和不同的离心时间（即依次增加离心转速和离心时间），就能够使非均匀混合体中的颗粒（此处为各种细胞器等）按其大小、轻重分批沉降到离心管底部，分批收集。主要细胞成分的沉降顺序是：细胞核及细胞碎片和质膜、叶绿体、线粒体、溶酶体和其它“微体”、微粒体（内质网碎片）、核糖体和大分子。 细胞器分离常用介质是缓冲的蔗糖水溶液。它比较接近细胞质的分散相，具有足够的渗透压防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰较小，在pH=7.4的条件下，细胞器不容易发生聚集。 实验用品 ⒈材料：小白鼠肝脏。 ⒉试剂 ⑴生理盐水。 ⑵0.25 mol/l 蔗糖– 0.01 mol/l Tris –盐酸缓冲液（pH=7.4） ⑶0.34 mol/l 蔗糖–0.01 mol/l Tris –盐酸缓冲液（pH=7.4） ⑷0.34 mol/l 蔗糖–0.5 mol/l Mg(Ac)2溶液， pH 7.4 ⑸0.88 mol/l 蔗糖–0.5 mol/l Mg(Ac)2溶液，pH =7.4 ⑹1％詹纳斯绿（Janus green B）染液，用生理盐水配制 ⑺甲基绿–派洛宁（methyl–green–pyronin Y）染液 ⑻卡诺（Carnoy）固定液 ⑼丙酮 ⒊器材：冷冻高速离心机、玻璃匀浆器、冰箱、显微镜、解剖刀剪、漏斗、300目尼龙网、离心管、载玻片、盖玻片。 实验方法 ⒈制备小鼠肝细胞匀浆 实验前小鼠空腹12 h，颈椎脱臼处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2 g，剪碎，用预冷的0.25 mol/l 蔗糖溶液洗涤2～3次。然后按每克材料加入9 ml冷的0.25 mol/l 蔗糖溶液（分数次添加），在0～4 ℃冰浴中用玻璃匀浆器制备肝匀浆。匀浆用300目尼龙网过滤备用。 ⒉差速离心 先将9 ml 0.34 mol/l 蔗糖溶液放入离心管，再沿管壁小心地加入9 ml 鼠肝匀浆覆盖在上层。按下面各图进行差速离心。 ⑴分离细胞核 ⑵吸出质膜：吸出细胞核沉淀中较疏松的上层。 ⑶细胞核纯化 将细胞核沉淀（按0.5 ml计算）悬浮于5倍体积（2.5 ml）的0.34 mol/l 蔗糖–0.5 mmol/l Mg(Ac)2溶液中，铺在4倍于核悬液体积（10ml）的0.88 mol/l蔗糖–0.5 mmol/l Mg(Ac)2溶液之上，1500×g（3550 r/min）离心20 min，弃上清，沉淀为纯化的细胞核。 涂片、染色、镜检。 纯化的细胞核在RSB溶液中置于4 ℃可保存数天，–20 ℃可保存数月。 ⑷分离线粒体 ⒊分离物鉴定 ⑴细胞核 取沉淀的细胞核作稀薄的涂片，入卡诺固定液30 min后，取出晾干，入甲基绿–派洛宁染色10～30 min，入纯丙酮分色30 s，蒸馏水漂洗，然后用滤纸吸干水分，40倍物镜下检查。结果：细胞核呈蓝绿色，核仁和混杂的细胞质RNA呈红色。纯化的细胞核上应无大量胞质粘连，背景中完整细胞低于10％，无细胞碎片。 ⑵线粒体 取线粒体沉淀作稀薄涂片，不待干即滴1％詹纳斯绿B染色液染10～20 min，扣上盖玻片，显微镜检查，线粒体呈蓝绿色。 注意事项 ⒈实验操作时，要注意使样品保持在0～4 ℃，以免酶失活。 ⒉尽可能充分剪碎组织，缩短匀浆时间，整个分步分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 作　业 写出分离所得组分的鉴定结果并作图，并估计各组分的纯度。 * * 实验原理 组织经过匀浆化后，放在均匀的悬浮介质上，即可用差速离心法分离其亚细胞组分。 球形颗粒在均匀的悬浮介质中的沉降速度取决于离心场G、颗粒的密度、半径以及悬浮介质的粘度。 （公式1） 式中n 为转速（r/min），r为颗粒到旋转轴的辐射距离（cm），π值为3.1416。 （公式2） 对于一定的离心机转头，r值是恒定的，改变转速n便得到不同的RCF。