复苏促进因子结合蛋白B的原核表达及对藤黄微球菌促生长作用：ResuscitationpromotingfactorbindingproteinexpressedinprokaryoticexpressionofBandgrowthpromotingeffectofMicrococcusluteus.docVIP

结核分枝杆菌RipB基因的克隆，表达及生物学活性效果 王刚，范立强*，程安阳，李小灵，潘忠孝，朱庆庆,孟军 （华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海，200237） 摘要：目的构建表达肺结核分枝杆菌RipB蛋白的重组质粒，并在大肠埃希茵中表达获得重组蛋白。方法提取肺结核分枝杆菌基因组DNA，通过PCR扩增出RipB基因，克隆入pET-21a的表达载体，测序正确后转化到大肠埃希茵BL21(DE3)，在37℃用IPTG诱导5 h后进行SDS—PAGE分析。结果测序结果证实获得了肺结核分枝杆菌的RipB基因，其序列与GenBank中报道完全一致；SDS—PAGE分析表明，RipB基因在大肠埃希茵BL21(DE3)中表达了重组蛋白，表达的蛋白量约占茵体蛋白的40%。结论成功克隆了肺结核分枝杆菌RipB的基因，并在大肠埃希茵中获得了高效表达，并且进一步研究该蛋白对藤黄微球菌的生长促进作用, 发现在100pmo/L的浓度下，促生长作用效果最好。 关键词：结核分枝杆菌 RipB 克隆 表达 效果 Mycobacterium tuberculosis the RipB Cloning,expression and biological activity performance Wang gang, FAN Li-qiang,CHENG An-yang, LI Xiao-ling ,PAN Zhong-xiao, ZHU Qing-qing， MENG Jun (State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China) Abstract: According to the sequence of RipB, we designed primers, and amplified the gene of RipB with the genome of Mycobacterium tuberculosis as templates. We constructed plasmid pET-21a-RipB, and transformed them into the recombinant E. coli, respectively. According to the experiment of inducing express conditions optimization, we found the optimal expression conditions RipB was 0.5mmol/L, inducing 12 h at 15°C. We tested virous concentration of RipB promoted the recovery and multiplication of Micrococcus luteus, and found that RipB accelerated the multiplication of Micrococcus luteus at 100 pmol/L. 肺结核仍然是严重危害人类健康的重大公共卫生问题[1]。肺结核分枝杆菌的检出是肺结 核诊断的金标准，但是目前常规的培养诊断阳性率不高，为结核病的诊断和治疗带来了一定 作者简介：王刚 (1985一)，男，山东滨州人，硕士 研究生，生物化学与分子生物学专业。 *通讯作者：范立强，女，副教授，硕士生导师， E-mail：fanglq@ecust．edu． 的困难，因此快速的培养肺结核分枝杆菌是肺结核诊断的关键。目前研究表明一种在革兰氏阳性细菌的活跃代谢过程中产生的蛋白（Resuscitation promoting factor,Rpf)能够明 显促使休眠的细菌活跃。它能够在皮摩尔的浓度下有效促进休眠的革兰氏阳性细菌复苏和生长。研究表明，RpfB能够进一步作用于细胞壁的一种复苏促进因子结合蛋白A (RipA)，两者相互结合共同起作用促进革兰氏阳性细菌复苏和生长[2]。并且进一步研究表明在肺结核分枝杆菌的表面还存在另外一种和RipA性质类似的RipB[3]。我们将结核分枝杆菌的复苏因子促进结合蛋白（RipB）进行克隆，表达并且纯化。获得的RipB蛋白应用于藤黄微球菌的复苏实验中，观察不同蛋白浓度的复苏效果。 1 实验部分 1.1材料 大肠杆菌DH5α、BL21（DE3），原核表达载体pET21a（+）由本实验室保存。pMD18-T载体购自宝生物工程(TaKaRa)公司。 DNA Marker、Taq DNA