寡胺-葡聚糖类阳离子化合物合成及其在基因转染中的应用.pdfVIP

助 锨 财 料 寡胺一葡聚糖类阳离子化合物合成及其在基因转染中的应用’ 陈建海，平 渊，马守栋，江永南 (南方医科大学南方医院药学部，广东广州510515) 摘要：应用氧化葡聚糖与精胺通过还原胺法反应， 染时的转染效率的影响。 制备了聚阳离子非病毒基因载体葡聚糖一寡胺化合物； 2 实 验 用红外光谱测定仪、核磁共振波谱仪、紫外光谱仪，激 光纳米粒度测定仪、透射电子显微镜进行了表征。证 2．1试剂与仪器 实了该载体为葡聚糖一精胺化合物DSP。其平均粒径 2．1．1试剂 为170nm，Zeta电位为+31．1mV，镜下呈园球形状。 将载体DSP与pCMV—GFP的质粒DNA以8：1(N／ P)组成复合物时，对SMMG7721人肝癌细胞进行体 外转染，转染效率高于阳性对照组transfectine2000， 为31．1％。实验表明该材料有望成为临床的非病毒 基因载体。 关键词：葡聚糖；精胺；聚阳离子；复合物；转染率 染试剂(由华美生物工程公司提供)；胎牛血清(杭州四 中图分类号： Q782 文献标识码：A 季青生物制品公司)，其它试剂均为国产AR级。 文章编号：1001-9731(2009)05-0836-042．1．2仪器 Orion 1 引 言 基因治疗最初是用于纠正遗传疾病中单基因缺陷 的手段，近年来也大量用于临床癌症治疗。基因治疗 TE 所面临的难题之一就是开发安全、高效的基因治疗载 型，英国)；荧光倒置显微镜(日本Nikon2000一U)； 体。目前临床试验中所用的载体主要有两类：病毒载 PerkinElmer 体和非病毒载体。病毒载体转染效率高，占所用载体 JEM型透射电镜(日本电子公司)。 总量的75％左右，但其存在的非靶向性、有限的携带 2．2实验方法与步骤 能力、生产和包装以及安全性的困扰等问题，特别是在 2．2．1基因载体DSP的合成 90年代发生的2例基因治疗死亡事故，使得近几年研 采用还原胺化法合成。精密称取葡聚糖及过碘酸 究重点逐渐转向非病毒载体。非病毒载体的最大优点 钠适量，置于圆底烧瓶中，以适量溶媒溶解，室温下搅 是不会象病毒载体那样导致受体癌变，并且具有低毒、 拌3．5～4．5h，将反应混合液置截流相对分子质量为 低免疫原性、能够携带大量DNA分子、容易大批量生 产及费用低廉等优点[1]。 2d，透析液冷冻干燥，得氧化葡聚糖。 国内外大量研究应用表明，水溶性生物可降解的 精密称取氧化葡聚糖适量，以蒸馏水溶解并稀释 阳离子聚合物作为基因载体具有广阔的应用前景口]。 至一定浓度，为A液；精密称取精胺适量，以pH=11 目前阳离子聚合物类基因载体主要包括：聚左旋赖氨 硼酸盐缓冲液溶解并稀释至一定浓度，为B液。室温 酸(PLL)及其嵌段或接枝共聚物、聚乙烯亚胺(PEI)、 搅拌下将B液缓缓加入到A液中，待反应液变成黄色 多糖(如壳聚糖)、PAMAM树状大分子及其它聚合物后，向其中加入硼氢化钠适量，室温下继续反应2d，反 如聚甲基丙烯酸(PMA)等。其中，将寡胺接枝于天然 多糖的新型可降解阳离子聚合物，是一类具有潜在临 2d，透析液冷却干燥，得目标化合物基因载体。 ’ 床应用前景的载体系统口“]。本研究着重基因载体葡 2．2．2载体的表征 聚糖一精胺阳离子聚合物(以下简称DSP)的制备及表 氧化葡聚糖醛基含量的测定。氧化葡聚糖醛基含